食品及飼料中動物性成分種類的鑒別方法
牛海綿狀腦病（BSE，又稱瘋牛病）是牛的一種致死性神經係統疾病，即眾所周知的傳染性海綿狀腦病（TSE），最近科學家推測進食含BSE的牛肉與人群發生變異型克雅氏病（vCJD）有關。這些疾病的特征是潛伏期長，可從數月至數年，潛伏期內無可見症狀，牛BSE平均潛伏期為4～6年，在人是至少9年，患者出現短暫神經症狀後死亡，目前尚無有效治療方法。目前在英、法、德、瑞士、丹麥、阿曼、葡萄牙、愛爾蘭、比利時、盧森堡、西班牙、意大利等國均有報道。至2000年1月份，英國共有384萬多頭牛被銷毀。自從英國於1996年發生第1例vCJD病以來，到2000年1月，單英國就有52人患此病死亡。因此BSE對人畜健康和食品安全衛生的影響後果非常巨大，引起世人廣泛關注。對於該病病原，普遍認為是由一種蛋白質性的感染顆粒也稱為朊蛋白引起的，是一種病理細胞朊蛋白（PrPSc），由正常細胞朊蛋白（PrPc，約250個氨基酸的蛋白質）轉變而來，不含DNA或RNA。病原對外界理化因素抵抗力極強，高壓蒸汽滅菌134～138℃18min不能使病牛腦組織完全滅活，對次氯酸鈉溶液，NaOH溶液有很強抵抗力，常規組織固定方法不能滅活。BSE流行病學和傳播途徑研究表明，BSE的發生可追溯到被TSE如癢病病原汙染的加工飼料成分、白粉及肉骨粉（MBM）等，MBM是哺乳動物組織加工產品，是最普遍應用的動物飼料的蛋白質來源，MBM被認為是主要的傳播途徑，而今MBM在許多國家被禁用於反芻動物飼料，對動物飼料的控製、禁止使用反芻動物蛋白甚至所有哺乳動物組織成分詞喂反芻動物，禁止牛源性風險成分進入動物及人食物鏈是防止BSE侵入和傳播，保證人身安全免受VCJD侵害的關鍵措施。中國、歐盟各國、美國、日本等國都頒布了有關公告和禁令。能否很好地執行這些規定在很大程度上取決於檢測食品及反芻動物飼料中的禁止成分。食品和飼料中動物性成分及種類鑒別分析方法主要取決於對DNA、蛋白及骨片段的分析。但是食品和飼料製備過程中的熱處理可破壞及降解DNA及蛋白質，因此對這些分析方法有一定影響。
1DNA分析方法
DNA分析方法是分離鑒定生物性材料的一種常用方法，DNA存在於細胞核中（基因組DNA）、線粒體（線粒體DNA）以及植物細胞葉綠體等細胞器中。熱處理對DNA的結構有兩種影響，其一是使DNA變性，雙股DNA分子變成單股，某一DNA分子變性的溫度各不相同，取決於GC含量、鹽分、長度及DNA拓樸結構等。線性DNA通常在60～100℃變性；其二是改變DNA的初級結構，高溫高壓下DNA分子變成短片段。DNA分析方法的目標序列通常是種間高度保守的序列，核糖體DNA是常用的種類鑒別序列，衛星DNA及隨機重複序列也被應用到，其他數種染色體及線粒體DNA也被用於肉類鑒別，DNA分析方法常選用雜交及選擇性擴增方法。
1.1DNA雜交DNA雜交方法分指紋技術及完整DNA方法。前一種常用Southern印跡，在雜交前DNA被酶切成小片段，並按大小分開；另一種方法，如斑點雜交方法適用完整DNA分子。DNA指紋技術不適用於化製產品，因為DNA降解過程會產生不同大小的DNA片段，將會影響結果判定。斑點雜交技術適用於熱處理產品，該方法被應用於80℃、100℃及120℃加熱處理的雞、豬、山羊、綿羊及牛肉的DNA分析，探針是使用每種動物的基因組DNA。該方法檢測限可達0.lmg。但是山羊、綿羊與牛存在很大交叉反應，因為他們的基因組很相似。交叉反應可用未標記的綿羊DNA進行阻斷。為了鑒別熱處理肉類，以衛星DNA為靶序列設計的22個堿基的探針用於鑒別牛、山羊、綿羊、馬、鹿、豬、雞和火雞肉，經過120℃90min高壓處理，雖然強度減弱但雜交信號仍很清晰，檢測限可達l％～5％，另外用PCR產生的可與種類特異性衛星DNA結合的探針雜交技術更耐用，可檢測鮮肉0.l％～0.5％，高壓處理肉樣品0.5％～5％。
1.2PCR擴增PCR技術是應用耐熱DNA聚合酶特異性地擴增目的DNA片段，擴增的片段可以用以下方法進行分析和鑒別：凝膠電泳、DNA測序、單鏈同一性分析（SSCA）、質譜分析等。PCR方法使用幾種不同的目的序列，線粒體DNA是一種很好的序列，因為每個細胞中含有大量線粒體基因組（約2300個拷貝），方法的靈敏度大大提高，Tartaglia等介紹一種檢測反芻動物飼料中牛線粒體的PCR方案，該方法以牛線粒體DNA的tRNA的3′端、ATPase8和ATPase6的氨基端為目的片段，此片段在植物中未發現，並且在脊椎動物中表現為高度變異性。該方法可以檢測牛源性MBM0.125％樣品中的牛線粒體DNA，該方法經FDA多方評估，但沒有確定靈敏度，也非定量。而且該方法是牛特異性的，不能檢測其他反芻動物成分。另一種方法應用於鹽醃、加熱或發酵肉品的種類鑒別，所用引物是脊椎動物線粒體Cytb基因的保守區互補係列。對目的DNA片段的限製性內切酶分析可檢出多種野生動物及豬、牛、山羊、馬、雞、火雞的限製性片段多態性，PCR－RFLP分析方法從含牛肉的熱處理肉類混合物中檢出低於l％的牛肉。22種未知cytb基因序列的動物包括偶蹄動物和禽類的種內和種間差異可用20種不同限製性內切酶進行分析。有人研究了熱處理肉中豬肉的PCR檢測方法，該方法擴增18S核糖體及線粒體基因高度保守區序列，可從鮮肉及熱處理牛肉和豬肉混合物中檢出低於2％的豬肉。