應用酶聯免疫吸附法測定飼料中克倫特羅
克倫特羅是β-腎上腺素激動劑（簡稱β-興奮劑）的一種，從化學性質上看是苯乙醇胺的衍生物，其分子結構與腎上腺髓質等處分泌的腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類相似。在生理上，它們能抑製糖原合成酶並激活磷酸化酶，從而加速糖原分解，提高血糖和糖代謝率；通過作用於脂肪組織，可提高激素敏感脂酶活性，加速脂肪分解，提高血液中遊離脂肪酸濃度，促進其在肌肉組織中的氧化分解；增加心率、心血輸出量、心縮壓，提高骨骼肌、冠狀動脈和肝髒等局部血流量。在動物營養上，利用它具有促進畜禽脂肪分解、增加肌肉生長作用，作為營養重分配劑應用於飼料生產中。人食用了飼喂克倫特羅這種添加劑的動物所生產的畜產品後，由於畜產品中殘留的克倫特羅會引起中毒，通常會出現肌肉震顫、心悸、精神緊張、頭疼、肌肉疼痛、暈眩、反胃、嘔吐、發燒、發抖等症狀。因此，世界許多國家禁止在飼料中使用克倫特羅來增加動物的瘦肉率。我國政府已明文規定在畜牧生產中嚴禁使用克倫特羅等β-興奮劑。
目前，測定飼料中的克倫特羅的方法有高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC－MS）、氣相色譜-質譜聯用法（GC－MS）、高效液相色譜法（HPLC）和酶聯免疫吸附法（ELISA）等，通常以前兩種作為確認方法，後兩種作為篩選方法。農業部2001年頒布的強製性行業標準一飼料中鹽酸克倫特羅測定（NY－438）包括?GC－MS和?HPLC兩種方法，前者為仲裁方法。本文討論用ELISA方法測定飼料中克倫特羅的原理、準確度和精密度，為在生產實際中應用提供參考。
1??ELISA法原理
利用免疫學抗原抗體特異性結合和酶的高效催化作用，通過化學方法將植物辣根過氧化物酶（HRP）與克倫特羅（CL）結合，形成酶偶聯克倫特羅。將固相載體上已包被的抗體（羊抗兔IgG抗體）與特異性的抗克倫特羅抗體結合，然後加入待測克倫特羅和酶偶聯克倫特羅，它們競爭性與克倫特羅抗體結合，洗滌後加底物，根據有色物的變化計量待測克倫特羅量。若待測克倫特羅多，則被結合的酶偶聯克倫特羅少，有色物量就少。用目測法或比色法測定樣品中的克倫特羅含量，比色的最佳波長為450?nm，參比波長應大於600?nm。
2??檢測試劑與材料
2.l??克倫特羅酶聯免疫法測試盒組成
2.1.l??包被羊抗兔IgG抗體的聚苯乙烯微量反應板，24、48或96孔。
2.1.2??克倫特羅標準溶液，6個梯度：0、100、300、900、2700、8100?mg/L。
2.1.3??酶偶聯克倫特羅：CL與過氧化物酶的交聯物，濃溶液，使用前需用緩衝液稀釋。
2.1.4??底物液：過氧化氫鄰苯二胺溶液，過氧化氫濃度為0.3?％。
2.1.5??緩衝液：含?0.01～0.05?mol/L?pH?7.5磷酸鈉緩衝液（PBS），加入0.05％吐溫-20、0.l％牛血清蛋白（BSA）。
2.1.6??顯色劑液：用?pH?5.0乙酸鈉-檸檬酸緩衝液配製0.2?g/L的四甲基聯苯胺溶液。
2.1.7??終止劑：2?mol/L硫酸溶液。
2.2??其他試劑甲醇、0.L?mol/L鹽酸溶液、1?mol/L?NaOH溶液、重蒸水。
2.3??儀器設備??酶標儀（帶有450?nm濾光片）、離心機（5000?r/min）、震蕩器、微量移液器（20、50、100、200μL）。
3??檢測步驟
3.1???樣品處理??粉碎，過40目篩；準確稱取樣品1?g（準確至0.0001?g），放入離心管中（15?mL），加入?1?mL?0.mol/L稀鹽酸，混勻，加入?9?mL重蒸i水，混勻，置超聲波中20?min，離心（2000?r/min）20min，取上清液0.5?mL置於15?ML離心管中，用?1?mol/L?NaOH凋?pH?7～9，加入?9.5?mL重蒸水，混勻，離心（2000?r/min）20?min，取上清液2?mL置於10?mL試管中，加入3?mL重蒸水，混勻，上酶標板測定。