飼料中胰蛋白酶抑製劑鐵研究狀況
胰蛋白酶抑製劑(trypsinin-hibitor,TI)或稱抗胰蛋白酶因子(antitrypsin),是大豆以及其它一些植物性飼料中存在的重要的抗營養因子。在飼料工業生產和畜禽飼養實踐中,尤其是在用豆粕-玉米型日糧飼養畜禽的條件下,如何防止胰蛋白酶抑製對畜禽的危害是國內外普遍關注的問題。目前國外的研究較多地集中在胰蛋白酶抑製劑的結構及其與靶酶的作用機理、胰蛋白酶抑製劑的基因表達等方麵。國內近年對飼料中胰蛋白酶抑製劑的除方法及其效果開展了一些研究,對生產實踐起到了指導作用。
1胰蛋白酶抑製劑的來源
胰蛋白酶抑製劑廣泛存在於豆類、穀類、油料作物等植物中。胰蛋白酶抑製劑在這些作物在各部位均有分布,但主要存在於作物的種子中。在種子內,胰蛋白酶抑製劑主要分布於蛋白質含量豐富的組織或器官,定位於蛋白體、液泡或存在於細胞液中。例如大豆和綠豆種子中胰蛋白酶抑製劑的含量可達總蛋白的6%~8%。在不同作物種子中,胰蛋白酶抑製劑鐵活性各不相同。通常以大豆中胰蛋白酶抑製活性最高。
在禽類的蛋清中存在兩種蛋白酶抑製劑――卵類粘蛋白和卵清蛋白酶抑製。卵類粘蛋白可抑製豬、羊和牛的胰蛋白酶的活性,但對人的胰蛋白酶活性無抑製作用。卵清蛋白酶抑製劑可抑製牛和羊的胰蛋白酶及糜蛋折酶的活性。它們的存在可以防止蛋白質的分解,阻止細菌在蛋中繁殖,因而具有保護蛋黃和卵胚的作用。它們也是攝食生禽蛋後不易消化和易引起腹瀉的原因。
2胰蛋白酶抑製劑的生物化學性質
2.1大豆胰蛋白酶抑製劑的分子量較小(通常低於50000)的、具有生理活性的功能性蛋白質。目前研究得最多的是大豆胰蛋白酶抑製劑(soybeantrypsininhibitor,STI),它根據氨基酸序列同源性可分為以下兩類:
2.1.1Kunitz類抑製劑(Kunitztrypsininhibitor,KTI)
此類抑製劑由Kunitz(1945)首次從大豆中分離並結晶出來,因此而命名。這類抑製的分子量為20000~25000,由181個氨基酸和2個二硫鍵組成,活性中心(即直接參與和胰蛋白酶相互作用的部位)位於第63個氨基酸(精氨酸)和第64個氨基酸(異亮氨酸)之間。由於分子內隻有一個活性中心,因而又被叫做單頭(single-headed)抑製劑,主要對胰蛋白酶直接地、專一地起作用。這類抑製劑與胰蛋白酶的結合是定量地進行的,即1g分子(mol)的抑製劑可以結合lg分子(mol)的胰蛋白酶.
2.1.2Bowman-Birk類抑製劑(Bowman-Birkin-hibitor,BBI)
此類抑製劑是因為Bowman(1994)首先從大豆中分離並由Birk(1961)鑒定而得名.這類抑製劑的分子量為6000~10000,由71個氨基酸組成,含有7個二硫鍵。它有兩個活性中心,分別位於第16個氨基酸(賴氨酸)和第43個氨基酸(亮氨酸)與第44個氨基酸(絲氨酸)之間,可分別與胰蛋白酸和糜蛋白酶結合。由於抑製劑分子內有兩個活性中心,故被稱為雙頭(double-headeb)抑製劑。
Kunitz類和Bowman-Birk類抑製劑是大豆中最主要的兩類胰蛋白酶抑製劑,它們在大豆中的含量分別為1.4%和0.6%。這兩類胰蛋白酶抑製劑對熱、酸、堿的穩定性有所差異。純化的Kunitz類抑製劑在30℃以下溫度和pH值1~2範圍內保持其活性。在80℃短時間加熱能使它可逆地變性,而在90℃加熱則使它不可逆地失活。Bowman-Birk類抑製劑比Kunitz類抑製劑對熱、酸、堿的穩定性強。當在幹燥狀態、105℃加熱或用其0.02%水溶液在100℃加熱10min,仍可保存它們的活性(Fennema,1980).關於它們對熱的穩定性也右相反的報道,認為BBI比KTI對熱更不穩定(Dipietro和Liener,1989)。
2.2胰蛋白酶抑製劑與靶酶的反應機理
大豆中的胰蛋白酶抑製劑屬於絲氨酸蛋白酶抑製劑.它可以和胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶係(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)發生反應。胰蛋白酶抑製劑與其靶酶的相互作用,通常如酶與底物之間的相互作用一樣,屬於互補型作用機理。兩者反應時,抑製劑暴露在外的活性中心與靶酶的活性中心通過氫鍵相連接,形成穩定的共價型複合物,從而導致酶活性中心的閉鎖,使靶酶的活性喪失。兩者之間的反應用化學方程式表示為:
蛋白酶+抑製劑=蛋白酶與抑製劑複合物=蛋白酶+變性的抑製劑(Laskowski等,1980;Gueguen等,1993)
與通常的酶催化反應相比,蛋白酶與抑製劑之間反應的米氏常數(Km)很低,故蛋白酶與抑製劑的親和力大,二者可以迅速結合形成複合物.與一般酶的底物不同,抑製劑與酶結合形成複合物.與一般酶的底物不同,抑製劑與酶結合後期活性中心的肽鍵並不裂解或裂解速度極慢。因此,該複合物雖然可以分 解成遊離的酶和變性或未變性的抑製劑,但解離速度非常緩慢。
以上說明抑製劑從某種意義上講可看作是酶的底物(作用物),其與酶的接觸部位主要集中於抑製劑活性中心(反應位點)附近的氨基酸殘基。Sweet等(1974)和Laskowski等(1971)分別列出了大豆KTI和BBI活性中心附近的氨基酸序列(表1)
表1 大豆胰蛋白酶抑製劑反應位點(↓)附近的氨基酸序列