基於
COI
基因的龜甲及其混偽品的DNA條形碼研究
中藥資源評價與開發研究平台專題
作者：劉曉帆 劉春生 楊瑤珺 李軍德 徐佳 吳立潔 戴待 劉傑
[摘要] 目的：利用COI基因對烏龜及常見混偽品進行分子鑒定，探討快速、準確鑒定龜甲及其混偽品的方法。
方法：在全國範圍內收集龜甲的正品及其混偽品8種，共22份樣品，提取DNA，得到其COI序列。用Contig Express，Dnaman，Edit Sequence，Mega 5 等軟件進行變異位點分析，並構建正品龜甲其混偽品的N，J 樹。
結果：龜甲的正品來源烏龜與其混偽品種間存在較多變異位點。由所構建的係統聚類樹圖可以看出，同屬聚在一起，且各物種又形成相對獨立的支。
結論： 基於COI 序列的DNA 條形碼技術可以很好地鑒定龜甲及其混偽品。
[關鍵詞]龜甲；COI序列；DNA 條形碼
龜甲為常見動物類藥材，《中國藥典》2010年版規定爬行綱龜科動物烏龜Chinemys reevesii（Gray）的腹甲和背甲，具滋陰潛陽，益腎強骨，養血補心之功效[1]。但是在藥材市場上，龜甲的來源確十分的混亂，主要以巴西龜的背甲、腹甲居多，另外還有部分的緬甸陸龜、黃喉擬水龜、地龜、平胸龜等。
近幾年，隨著如龜苓膏、黃金酒、鹿龜酒等龜甲的相關產品的開發，其需求量增長迅速。因此，保護龜甲的優秀種質資源、防止混偽品充斥市場就成了保證龜甲藥材及其相關產品質量的重中之重。
DNA 條形碼技術是近來發展起來的物種鑒定新方法，通過對基因組中一段短的、標準的DNA 片段進行分析從而對物種進行準確鑒定，成為生物分類和鑒定的研究熱點和方向。尤其適用於來源於生物體部分組織或器官的中藥材的真偽鑒定[2，3]。2003年， PDN 等[4]對動物界11 個門13 320個物種的研究結果顯示， 線粒體COI基因對動物界刺胞動物門以外的物種存在顯著的序列變異， 並能夠進行有效的鑒定。國內尚無利用COI序列來鑒定龜甲與其混偽品的相關報道。本文主要考察全國龜類的主要產區的代表群體為研究對象，通過建立快速有效的DNA提取、PCR擴增方法，測定COI基因序列，比較其序列特征。考察利用COI序列鑒別龜甲與其混偽品的可行性。
1 材料
1.1 樣品 收集我國9個省區的23份龜類的種群種質資源，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定，其中8份為野生品種，14其餘為人工養殖品種，1份為藥材（為花龜）。
1.2 儀器 離心機（Sigma 3K15）；PCR儀（TECHNE TC，3000）；超低溫冰箱（SANYE -80 ℃）；電泳儀（BIO RAD）；電泳槽（君慧東方 JY，SPDT）；凝膠成像分析儀（培清科技 JS，68DB）。
1.3 試藥 上海生工生物UNIQ，10動物基因組DNA抽試提取試劑盒SK1205；Ezup動物基因組DNA抽試提取試劑盒SK8251；無水乙醇（北京化工公司，分析純）；Taq酶反應體係（Takara DR001AM）；2ΧPCRTaqMIX體係（美萊博公司2XPCRTaqMix）；引物LCO2198，LCO1490由上海生工生物合成。
2 方法
2.1 模板DNA的提取 取活體或凍存的龜類肌肉組織0.2 g，采用試劑盒法提取總DNA，DNA試劑盒為Ezup動物基因組DNA抽試提取試劑盒SK8251。龜甲藥材采用上海生工生物UNIQ，10動物基因組DNA抽試提取試劑盒SK1205。
2.2 PCR引物 采用COI基因通用引物 LCOI490（GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG），LCO2198（TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA）進行PCR擴增，引物由上海生工負責合成。