中醫藥對注意力缺陷多動障礙的動物實驗規範化探討
學術探討
作者：倪新強 張豔莉 韓新民
[摘要] 注意力缺陷多動障礙（ADHD）是兒童時期常見的行為障礙性疾病，近年來，中醫藥對ADHD的動物實驗研究逐漸得到發展，但在研究設計、動物福利等方麵仍存在不足，直接影響了中醫藥研究成果的真實性與認可度。該研究結合中醫藥本身的特點，對其中存在的問題進行探討分析，希望能有效推動中醫藥動物實驗規範化，充分發揮實驗動物科學在ADHD中醫藥研究中的作用。
[關鍵詞] 注意力缺陷多動障礙；中醫藥；動物實驗；規範化
近10年來，關於中醫藥幹預注意力缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder， ADHD）及其機製研究逐漸成為該領域研究熱點之一。Meta分析表明，中醫藥治療兒童ADHD的短期療效可能優於或類似於呱醋甲酯（methylphenidate， MPH），長期療效穩定，副作用少，無藥物依賴及成癮性；但同時又缺少多中心、大樣本臨床試驗的有力支持[1，2]。而中醫藥ADHD動物實驗研究水平、設計等諸多方麵參差不齊；利用PubMed， ISI Web of Science等數據庫檢索，尚未發現有ADHD中醫藥動物實驗研究被美國《科學引文索引》（SCI）收錄。本研究結合至今全部ADHD中醫藥實驗研究論文33篇（排除重複發表的文章），試圖從以下幾點對中醫藥ADHD動物實驗規範化進行探討。
1 實驗設計
動物實驗設計應當參照並遵守臨床實驗設計中隨機化、盲法、對照的三大原則。本研究所納入的ADHD中醫藥動物實驗研究中，除1篇外，均提到“隨機分組”，其中2篇“按體質量隨機”，10篇采用“稱重後，隨機數字表法”，其餘文章無對隨機分配方法的確切描述；無一篇文章在研究過程中實施盲法；常用對照組有正常組、模型組、陽性對照組，15篇文章設置以上3組，9篇文章中設模型組及陽性對照組，而另外10篇僅設立模型組；研究中每組動物樣本量6～12隻不等，均未說明實驗前是否進行樣本量的估計。
由於中藥複方處方量大、成分複雜及劑型、顏色、口味的特殊性，中藥掩味技術難度較大且效果不顯著，動物實驗難以采用雙盲設計，在療效評價時因不能排除研究者的主觀因素而易造成實驗結果的偏倚；同時，因ADHD模型——自發性高血壓（SHR）大鼠價格昂貴，某種程度上也局限了動物分組及樣本量的設計。為了避免因各種人為因素影響研究實施而造成選擇性偏倚，可以仿照臨床設計中的隱蔽分組，即產生隨機序列者和決定分配序別者不參與納入受試者、試驗過程及結果測量[3]。對於中醫藥動物實驗，因無法對灌胃者及動物實施盲法，對動物行為觀察者、數據檢測及采集者、統計分析人員施盲就尤為重要，相關人員隻能知道哪一組數據為A組和B組，而不知道具體分組細節及實驗目的；將盲法與隱蔽分組充分結合，減少各種因素幹擾，促進動物實驗研究的真實性。
2 實驗動物選擇
2.1 模型動物 ADHD的中醫藥藥理研究中，目前均采用“病”的動物模型，尚沒有“病證結合”的動物模型；而在“病”的模型中，采用的動物及造模方法也不盡相同。所納入研究中，1篇文獻采用利血平耗竭昆明種小鼠中樞兒茶酚胺類物質而模擬ADHD的某些病理特點；2篇文章對昆明種小鼠皮下注射去水嗎啡，激動黑質紋狀體係統內的多巴胺（DA）功能而造成ADHD模型；8篇對Swiss小鼠或昆明種小鼠或SD大鼠腹腔注射東莨菪堿，進而阻斷中樞膽堿能神經突觸信息傳遞而致ADHD模型；其餘22篇采用SHR大鼠作為模型動物。其中，SHR大鼠及SD大鼠均采用雄性動物；昆明種小鼠和Swiss小鼠雄雌各半。
以上動物模型中，通過化學因素損傷動物局部組織、器官，使其出現某些與ADHD核心症狀、合並症狀、病理生理等類似的表現，未能充分模擬ADHD的遺傳背景。而SHR大鼠能同時表現出注意缺陷、衝動、多動等ADHD的核心症狀，是公認的ADHD混合型動物模型[4]。然而，國內SHR大鼠來源不一，分別來自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（11篇）、北京維通利華實驗動物技術有限公司（4篇）、四川醫學科學院實驗動物研究所（7篇）；維通利華先後從美國Charles River實驗室引入SHR大鼠第23代及第46代核心群，另外2家公司的SHR來源尚不知。不同來源、品係的SHR大鼠遺傳背景、行為表現等特點不同，甚至可能有顯著差別，因此很可能得出假陽性或假陰性結果，造成相互之間缺乏可比性；而國內有些課題組，在研究同種中藥複方藥效的一係列的實驗研究過程中，先後采用不同來源的SHR大鼠，應充分考慮到模型的一致性。
2.2 正常對照動物 在22篇SHR大鼠作為ADHD模型動物的文獻中，采用Wistar，Wistar，kyoto （WKY）大鼠作為SHR大鼠正常對照動物分別有5篇和2篇，而兩者分別是SHR大鼠的遠交係及近交係對照動物，三者起源關係為Wistar→WKY→SHR；另有1篇設SPF級正常大鼠作正常對照組，但未明確動物品係；其餘文章均未設立正常對照動物。國外近年研究發現，以WKY/NHsd大鼠（源於Harlan實驗室）為參照，WKY/NCrl大鼠（源於Charles River實驗室）被認為是ADHD偏注意力障礙型的動物模型或抑鬱症模型，而SHR/NCrl（源於Charles River實驗室）常被用作研究混合型ADHD的良好動物模型[4，5]。國內研究中所采用的WKY大鼠品係尚不清楚。
2.3 動物年齡 ADHD最常見於兒童期或青春期，因此常選用相對於人類青少年期的幼年動物進行研究；關於大鼠與人類年齡的對應，目前趨於一致的認識為：大鼠出生後21～59 d相當於人類的青少年期[6，8]。國內采用SHR大鼠進行研究的文章中，大鼠起始周齡分別為8周齡（10篇）、8～10周齡（3篇）、11周齡（7篇）；另有2篇文章未提到大鼠周齡，但從文中大鼠體質量40～60 g判斷，可能為斷乳期幼鼠（3～4周齡）。
有研究表明，精神興奮性藥物對青少年的療效與成人也可能不同，藥物可能與大腦發育及神經元修剪交互作用以發揮藥物療效[9，10]；而國外研究中，動物接受藥物幹預的起始周齡大多為3～4周齡。因此，對ADHD模型SHR/NCrl大鼠進行研究時，應該在大鼠出生8～9周齡之內（高血壓前期）進行，因為隨著動物年齡增長自發性高血壓逐漸發展，對大腦功能產生不利影響而導致結果假陽性或假陰性[4，11]；中醫藥作為一種起效慢，作用時間長的特殊療法，需要長期給藥，在疾病早期給藥更能發揮較好優勢。
因此，不同品係、來源、年齡的動物在遺傳背景、行為表現等方麵上存在差異，對藥物的應答反應也不同；應根據實驗目的不同，選擇最佳的動物模型。
3 受試藥物
3.1 中醫藥 中藥複方是中醫藥防治ADHD的主要手段；由於中藥成分的複雜性，複方既是中藥治療ADHD的優勢也是研究的難點，其藥效物質基礎及製劑工藝標準化研究已成為中藥現代化的最重要研究課題之一。國內ADHD動物實驗研究的中醫藥複方主要有安神定誌靈（3篇）、益智寧（12篇）、多動停煎劑（6篇）、多動合劑（2篇）、孔聖枕中丹及益智寧神顆粒（各2篇），但均沒有複方製備工藝質量控製及有效成分（組）的前期報道；所采用的生藥大部分從醫院購得，沒有經過藥材鑒定；某些中藥複方在不同研究論文中，尚存在不同的製備過程及不同給藥劑量。
在中醫藥研究中，中藥材應經過生藥學鑒定（品種、產地）；中藥製劑的處方、劑型、製備工藝及藥品質量應基本穩定；指紋圖譜定性和指標成分定量相結合保證中藥質量控製；進行複方製劑工藝研究時，以藥效為前提，確定複方有效成分（組），根據其理化性質和特點，運用正交設計等，選擇適宜的提取、純化方法，並選擇、固化劑型[12]。中醫藥對ADHD的動物實驗研究中，中藥複方藥效物質成分的穩定性、一致性和可控性不夠，嚴重影響了實驗研究數據的可靠性及重複性。中藥血清藥理學及腦脊液藥理學方法的提出與應用，為中藥複方作用的物質基礎和作用機製研究提供了新思路[13]；目前尚未見對ADHD血清藥理及腦脊液藥理學的專項研究。
與中藥複方相比，在中醫藥理論指導下，運用化學手段提取的中藥單體和有效部分，具有確切的化學結構，藥效明確，進而來揭示中藥作用機製的研究方法，已逐步為國內外研究者認可。胡兵等對SCI收錄的中醫藥抗腫瘤文獻進行統計分析，發現其中實驗研究主要以單味中藥及中藥單體為主[14]；而ADHD的中醫藥動物實驗研究中，僅有川芎嗪（1篇）、人參皂苷Rg1（2篇）的報道，尚未有高水平的研究成果，處於研究的初級階段。
因此，以傳統中醫藥理論為指導，重視中藥化學與複方藥藥效的互參性研究，對中醫藥複方製備工藝進行質量控製；同時，運用中藥血清藥理學及腦脊液藥理學的研究手段，中藥複方、單味藥和有效成分（組）相結合將使中藥治療ADHD的作用靶點、作用環節及作用機製更加清楚。
3.2 陽性對照藥 鹽酸呱醋甲酯（methylphenidate， MPH）是ADHD臨床的首選藥物，常用來作為ADHD中藥藥效研究陽性對照藥。在24篇設置陽性對照藥的文獻中，主要有鹽酸呱甲酯片（利他林）、鹽酸呱甲酯控釋片及靜靈口服液3種；其中利他林給藥劑量存在較大差異：1.5 mg·kg-1·d-1（5篇），2.1 mg·kg-1·d-1 （3篇），3.9 mg·kg-1·d-1 （5篇），4 mg·kg-1·d-1 （3篇），5 mg·kg-1·d-1 （1篇），6.25 mg·kg-1·d-1 （2篇），10 mg·kg-1·d-1 （2篇），另有1篇無相關劑量報道；鹽酸呱甲酯控釋片劑量為5 mg·kg-1·d-1 （2篇）。以上文獻中均沒有MPH劑量的選擇依據或與臨床用藥劑量換算關係的論述；鹽酸呱甲酯控釋片臨床用法為：整片用水送下，不能咀嚼、掰開或壓碎，而用於動物實驗灌胃，其生物利用度及血藥濃度是否與臨床等效價，這一點仍值得探索。
藥物灌胃的劑量及途徑很重要，因為動物對藥物的應答依賴於藥物濃度的上升率及達到的最大血藥濃度。研究發現，認知功能的核心元件、持久的注意力及工作記憶，都可以被低劑量的MPH所改善；齧齒動物經口服用2 mg·kg-1·d-1劑量的MPH，被認為最具有臨床相關性[15，16]；Kuczenski等研究發現，經口給予青少年期大鼠≤3 mg·kg-1·d-1劑量的MPH，可以產生類似於服用MPH的兒童的血藥濃度，同樣可以明顯降低行為活動[17，18]。