流式細胞術分析比較癌症患者新鮮和凍存複蘇後外周血淋巴細胞亞群的實驗研究
基礎醫學
作者：魏天雪 於鴻 何春瑩 劉玉俠
[摘要] 目的 建立標準化的實驗和分析方法，采用流式細胞術比較分析癌症患者新鮮和凍存複蘇後的外周血淋巴細胞亞群的差異。 方法 於2014年6～12月收集肺惡性腫瘤患者靜脈血樣本（2 mL/樣本），每個樣本取300 μL全血用於淋巴細胞亞群分析；剩餘全血經裂解紅細胞後凍存 （40%或90%胎牛血清）。30 d後複蘇細胞，流式細胞術分析淋巴細胞亞群變化。 結果 複蘇並培養24 h後，癌症患者PBMC的存活率分別為（67.70±2.80）%（90% FCS） 和（80.47±3.32）% （40% FCS，P=0.0069）。新鮮和凍存的的外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+56+、CD3+CD16+56+和CD4+CD25+ T細胞的百分率之間無顯著差異（P>0.05，n=8，40%FCS）。 結論 短期凍存癌症患者的PBMC可用於後續檢測T淋巴細胞亞群，尤其對於晚期癌症患者而言，可避免多次采血造成的負擔同時提高實驗的一致性。此外，本實驗建立的方法也可用於臨床抗腫瘤免疫治療和其他免疫監測。
[關鍵詞] PBMC；細胞凍存和複蘇；淋巴細胞亞群；流式細胞術
[中圖分類號] R329.2；R697.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）29-0029-03
Comparative analysis of lymphocyte subsets between fresh and frozen cancer patients PBMC by flow cytometry
WEI Tianxue YU Hong HE Chunying LIU Yuxia
Jilin Tumor Institute， Changchun 130012，China
[Abstract] Objective To develop a protocol to comparative analysis of lymphocyte subsets between fresh and cryopreserved cancer patients PBMC for immunological studies by flow cytometry. Methods Blood samples （2 mL/sample） from lung malignant tumor patients were collected by venipuncture from June to December 2014. For each sample， 300 μL of fresh whole blood was immediately used for lymphocyte subsets analysis. While the remaining were lysed and the isolated PBMC were cryopreserved with 40% or 90% FCS. Following storage for 30 days， the samples were removed and quickly thawed in 37℃ water bath. After cultured for 24 h， the cells were stained with antibodys. The analysis was performed using an Epics XL/MCL flow cytometry（Beckman Coulter）. Results After separating， the cell recovery of PBMC was（67.70±2.80）% of 90% FCS vs （80.47±3.32）% of 40% FCS（P=0.0069）. There were _disibledevent=8， 40%FCS）
3 討論
機體的免疫功能異常與惡性腫瘤的發生、發展、轉移及預後密切相關，在抗腫瘤免疫應答中也起著重要作用[5]。淋巴細胞亞群是反映細胞免疫功能的重要指標，其中T細胞起中心調控作用，CD3+總T細胞又分為CD4+輔助/誘導細胞和CD8+抑製/細胞毒細胞。此外，NK細胞、巨噬細胞等其他細胞也具有重要的免疫調節作用。臨床檢測癌症患者各淋巴細胞亞群的表達水平，可以動態分析臨床治療過程中患者機體免疫功能的變化，尤其對於應用免疫療法的患者而言，客觀評價免疫治療的臨床療效一直是我們需要麵對的關鍵問題[6]。