艾滋病免疫重建不全患者TCRVβ基因多樣性改變及藥物幹預研究
臨床實驗
作者：湯豔莉 王階 李勇 劉詠梅
[摘要] 目的：探討艾滋病免疫重建不全患者的TCRVβ基因多樣性改變及中藥免疫2號方的幹預作用。方法：采集37例艾滋病免疫重建不全患者治療前後的外周血PBMC，另以15例HIV抗體陰性健康獻血員做對照，采用人類TCRVβ基因CDR3多樣性定量檢測試劑盒檢測，基因掃描作圖並計算Vβ家族中每個家族不同大小CDR3 區片段的分布。 結果：HAART治療後1年免疫重建不全患者的TCRVβ多個家族的掃描圖高斯分布被打破，並發生TCR譜係的偏移，經半年中藥聯合HAART治療後，偏移的TCR譜係有所恢複。以試劑盒提供的定量分析軟件計算的距離D（distance）值來量化評價，2組D值改變無明顯差異，但聯合中藥能減少數據的變異性。CD4+T細胞計數與TCRVβ基因多樣性改變兩者存在顯著的相關關係（r=-0.772，P=0.000）。結論：中藥複方對於TCRVβ各家族單寡克隆情況有不同程度的改善和恢複，提示中醫藥可能促進T細胞部分受體基因重排，豐富受體庫，幫助機體免疫細胞有效識別病毒，減少T細胞凋亡。
[關鍵詞] 艾滋病；免疫重建不全；TCRVβ；免疫2號方
當前，高效抗逆轉錄病毒療法（HAART）是治療艾滋病唯一公認有效的治療手段，在臨床上得到了廣泛應用。然而HAART治療後免疫重建不全卻成為HAART療法問世以來難以解決的瓶頸問題之一[1]。TCRVβ基因是近年來免疫研究的熱點，AIDS病程中進行性的CD4+T細胞丟失及CD8+T細胞強大的免疫應答反應會影響不同TCR的可利用譜係，由抗原持續刺激而克隆性增生的CD4+和CD8+T細胞最終導致TCR可變區譜係的偏移及T細胞克隆性的變化，打破其平衡狀態下的高斯分布[2]。通過分析TCRVβ的基因譜係和CDR3長度和序列，可以精確地分析不同TCRVβ亞家族T細胞的基因表達和克隆性，是目前分析T細胞克隆性最為敏感的方法[3]。該方法能夠很好地對HIV/AIDS患者外周血T細胞TCRVβ亞家族的表達和克隆性進行分析，從而深入了解機體的免疫功能和對HIV相關抗原的特異性免疫反應情況。近年來有研究證實中藥免疫2號方聯合HAART能夠有效提高患者免疫功能，促進免疫重建，本研究對TCRVβ基因多樣性的改變進行檢測，初步探索該療法對機體免疫調節的作用機製。
1 材料
1.1 臨床資料 37例艾滋病免疫重建不全患者均來源於廣西柳州龍潭醫院，均為HIV抗體陽性，經Western Blot確認試驗證實，經HAART治療12個月以上，病毒載量控製良好，CD4+T細胞計數上升不足100個/μL的患者。另選取性別、年齡相匹配的15例HIV抗體陰性健康獻血員為對照組，來源於廣安門醫院體檢中心。
1.2 藥物 37例患者隨機分為2組，一組按照前期服藥方案繼續給予國家標準HAART治療方案，即AZT（d4T）+3TC+NVP（EFV），並聯合使用中藥免疫2號方（四川新綠藥業有限公司生產並提供），6.2 g/次，早、晚餐前0.5 h衝服。30 d/周期，連續治療6個周期。
1.3 儀器和試劑 生物安全櫃（Class Ⅱ，美國NuAire 公司），台式高速離心機1-15K（德國Sigma 公司），渦旋振蕩器（IKA-MS1/MS2，IKA 公司），可調移液器（Eppendorf公司），FACS Calibur流式細胞儀及MultiTEST軟件自動分析數據（美國BD公司），定量PCR儀（ABI 7500 FAST），3700測序儀（ABI）。TCRExpress Human T Cell Receptor Vβ Repertoire CDR3 Diversity Determination and Quantitative Analysis Kit（美國BioMed Immunotech公司），人淋巴細胞分離液（國產，天津川頁），TRizol試劑（Invotrigen），RNA抽提試劑盒（Qiagen），RNA逆轉錄試劑盒（Invotrigen）；Taq Polymerase（Invotrigen），RNA酶抑製劑（epicentre），RNeasy MinElute純化試劑盒（Qiagen）。
2 方法
2.1 樣本采集及外周血單個核細胞（PBMC）分離 抽取受試者5 mL外周血，EDTA 抗凝，無菌條件下Ficoll液常規方法分離PBMC，每管加入0.5 mL Trizol 試劑，充分抽打、混勻，置於-80 ℃以下保存。運輸樣品時嚴格控製運輸的冷凍狀態，防止樣品凍融。
2.2 提取細胞總RNA 用Qiagen公司的RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，依試劑盒說明操作。取3 μL跑膠鑒定。
2.3 RNA逆轉錄 用Invotrigen公司的RNA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，依試劑盒說明操作。