一般人們把整個啤酒發酵過程大致分為酵母活化階段、酵母有氧呼吸階段、酵母無氧發酵階段三個階段。這三個階段並非截然分開,在酵母的有氧呼吸和無氧發酵時還涉及口味的成熟,即通常所說的雙乙酰還原。考慮到有利於啤酒過濾和啤酒非生物穩定性的要求,在啤酒口味成熟後還需要低溫貯存啤酒。
在發酵過程中通過酵母的生理代謝作用,產生了各種代謝產物。發酵機理研究即是探究這些產物的轉化原因和過程。發酵機理非常複雜,麥汁經過一係列生物化學變化,最終得到C2H5OH、CO2和其他代謝副產物。發酵機理中有些問題至今還不十分清楚,還在不斷地探索和研究中。
歸納起來,發酵機理包括以下方麵:糖類的發酵;含氮物質的轉化;其他代謝副產物的形成和分解。
一、糖類的發酵
糖化、冷卻後的麥汁為酵母細胞提供了良好的生存環境和充足的營養物質,包括可發酵性糖、低分子氮等。在發酵中最主要的是酵母對可發酵性糖的降解。
1.麥汁中的可發酵性糖及酵母利用的順序
糖類物質占麥汁浸出物的90%以上,麥汁中能夠被啤酒酵母利用發酵的糖稱為可發酵性糖。在發酵過程中麥汁中的可發酵性糖按下列順序進行酵解:①葡萄糖;②果糖;③蔗糖;④麥芽糖;⑤麥芽三糖。
不能夠被啤酒酵母利用發酵的糖,包括麥汁中麥芽四糖以上的低分子糊精、異麥芽糖、五碳糖等,最後留在成品啤酒中。
葡萄糖和果糖由於相對分子質量小,首先滲入酵母細胞內,被啤酒酵母利用。蔗糖需經酵母分泌在酵母細胞表麵的蔗糖酶轉化為葡萄糖和果糖後,才能進入酵母細胞,進行發酵。
啤酒酵母對麥芽糖和麥芽三糖的作用,因酵母種類不同而異。在發酵一定程度後,啤酒酵母會分泌出麥芽糖與麥芽三糖滲透酶,使麥芽糖與麥芽三糖得以進入酵母細胞內,再經α-葡萄糖苷酶分解為單糖後,始能發酵。
實際上啤酒酵母進行的物質交換,並不是簡單的擴散吸收,而是通過載體輸送的方式進行營養物質的吸收,一般以輕鬆式擴散和主動性輸送的方式吸收。
(1)輕鬆式擴散受酶控製的吸收,通過非相當量交換與滲透酶相結合,沿濃度梯度進行,適合大分子,相對來說吸收較快。
(2)主動性輸送依賴能量的輸送,借助ATP傳遞作用除去和吸收質子,沿濃度梯度進行吸收,大部分的營養物質通過主動性輸送被吸收。
2.可發酵性糖的發酵途徑
啤酒酵母屬於兼性微生物,在有氧和無氧的條件下都能生存,所以啤酒酵母利用可發酵性糖有兩種情況——有氧呼吸和無氧發酵,並且糖降解還有其他幾種途徑。
(1)在有氧條件下,酵母有氧呼吸可發酵性糖被分解為水和二氧化碳,並釋放出能量。每1mol葡萄糖在有氧呼吸時釋放的能量為2822kJ,大部分轉移到ATP高能鍵中,作為酵母繁殖獲取能量的來源。
(2)在無氧條件下,酵母進行無氧發酵可發酵性糖被分解成乙醇和二氧化碳,並釋放出能量。每1mol葡萄糖在厭氧發酵時釋放的能量為209kJ,其中約96kJ的熱量轉移到ATP高能鍵中,其餘部分以熱能形式散發。啤酒發酵主要屬於這一種情況。
經過化學計算得:1g葡萄糖完全發酵時,可得約0.51g酒精和約0.49g二氧化碳(理論值)。
但在實際中,麥汁浸出物中的可發酵性糖約占總糖的70%左右,通常以麥芽糖含量表示。發酵時96%的可發酵性糖用於形成C2H5OH、CO2(其中80%在前發酵被利用);2.5%的可發酵性糖用於其他代謝產物的形成;1.5%的可發酵性糖用於合成新的酵母細胞。發酵度也不可能達到100%。
(3)EMP途徑麥汁中的各種可發酵性糖的代謝,無論是有氧還是無氧代謝,都是先經過糖酵解途徑(EMP),然後再進入有氧的三羧酸循環或無氧發酵。EMP途徑共有10步連續的酶促反應,有10多種酶,以及ATP、NAD、金屬離子Mg2+、Mn2+等參與,大部分首先以磷酸化的形式進行,反應中的ATP為能量轉移體,以NAD為氫傳遞體,生成非常重要的中間產物丙酮酸(中間產物)。當然在此步反應中,也會有少量的甘油產生。
1分子葡萄糖可生成2分子丙酮酸。
(4)TCA回路(三羧酸循環)在有O2的條件下丙酮酸首先氧化脫羧生成乙酰輔酶A,乙酰輔酶A隨後進入TCA循環徹底氧化生成CO2和水,並釋放出大量的能量。
TCA——也包括10步酶促反應。1937年英國生化學家Krebs提出假設,並已證實。
(5)在無O2條件下活性丙酮酸經酶作用轉化為活性乙醛,並釋放CO2,再經乙醛到乙醇(酵母發酵的主要過程)。
(6)克雷布特(Crabtree)效應和巴斯德(Pasteure)效應
①克雷布特效應:盡管麥汁中存有氧,但由於麥汁中葡萄糖含量高或缺乏磷酸鹽,會抑製酵母的有氧代謝,從而開始厭氧發酵,產生酒精,酵母收得率下降,這種呼吸作用減弱稱為克雷布特效應。在酵母擴培時應消除葡萄糖含量高對酵母有氧代謝、酵母繁殖的不利影響。通常方法是緩慢地添加培養介質、強烈的麥汁通風,促進酵母繁殖;對於高濃麥汁發酵來說,由於濃度高,不利於氧的溶解,再加上葡萄糖含量高些,不利於酵母繁殖,形成酒精、酯就會多些。
②巴斯德效應:實踐證明,酵母在有氧呼吸時,通過三羧酸循環可獲得更多的生物能(38個ATP),無氧代謝會受到抑製,降低酒精發酵作用,這種有氧代謝抑製厭氧呼吸的作用稱為巴斯德效應。
通過對克雷布特效應和巴斯德效應比較來看,酵母菌的糖代謝受到氧和糖濃度的影響,使呼吸和發酵作用間彼此相互調節,但啤酒酵母一般具有較弱的巴斯德效應和較強的克雷布特效應。
3.發酵過程中對可發酵性糖變化的要求
發酵過程中要求酵母能盡可能徹底發酵麥汁中的可發酵性糖,這是發酵結束的依據之一,有利於成品啤酒的發酵度達到工藝要求,有利於啤酒生物穩定性。其次保持適當的可發酵性糖下降的速度,確保形成合理的代謝產物。糖類變化減少的數量,通常以發酵度表示。在發酵工藝相同的條件下,啤酒發酵度的高低,由麥汁中可發酵性糖含量的多少決定。發酵時降糖速度的快慢,隨著發酵溫度、壓力,酵母添加量、對流等情況而變化,發酵溫度越高,壓力越低,酵母添加量越多,發酵速度越快。
二、含氮物質的同化與變化
麥汁中的總氮含量650~1000mg/L(包括高分子、中分子、低分子的含氮物質),啤酒中的總氮含量300~700mg/L。通過發酵這些含氮物質下降了約1/3,導致含氮物質下降或變化的原因如下。
(1)低分子含氮物質(氨基酸和二肽)被酵母利用,由於啤酒酵母胞外蛋白酶活性很差,不能分解相對分子質量高的含氮物質,高分子含氮物質也不能進入酵母細胞。
(2)由於發酵液的溫度和pH降低,發酵液中高分子的含氮物質和多酚物質結合,形成蛋白-多酚複合物,沉澱除去。
(3)酵母細胞表麵也吸附了少量蛋白質。
(4)隨著CO2氣泡上升而進入泡蓋。
(5)啤酒酵母在發酵時會分泌部分含氮物質(包括酶),酵母自溶後也會有高分子含氮物質進入到啤酒中。
1.含氮物質的同化與變化的意義
(1)提供酵母的營養,合成酵母細胞中的蛋白質,構成酵母細胞質並有利於酵母的繁殖、生長。
(2)用於合成滲透酶和其他酶(酶的本質就是蛋白質)。
(3)酵母進行物質代謝,如發酵副產物高級醇形成、雙乙酰形成和還原。
(4)對啤酒泡沫、醇厚性和非生物穩定性起主導作用。
(5)對啤酒口味的影響。
另外,在同化含氮物質的同時,還能分泌出一些含氮物質。在發酵旺盛時,同化>分泌;發酵快終了時,分泌較顯著。
在啤酒發酵過程中除了充分利用酵母發酵作用、還原雙乙酰作用,形成的代謝產物賦予啤酒獨特的風味以外,一定要避免發酵時酵母可能帶來的負麵作用。
早在1938年,丹麥的Nielsen就研究證明:酵母發酵時大約能分泌出它利用氮量1/3的含氮物質。所以,啤酒中的氮大約75%來源於麥汁,25%來源於啤酒酵母的分泌物。酵母的分泌物包括有生命的啤酒酵母分泌的一些酶,如蛋白質分解酶A、蔗糖酶。對於熟啤酒而言,因巴氏殺菌後啤酒中不應存在蛋白質分解酶A、蔗糖酶的活性,但對於純生啤酒來說,或多或少會存在一定活力的蛋白質分解酶A,由於啤酒pH在蛋白質分解酶A的最適pH範圍內,使蛋白質分解酶A在啤酒中呈活化狀態,能分解啤酒中的泡沫蛋白質,導致純生啤酒泡沫穩定性下降,醇厚性變差,影響純生啤酒的質量。
其次,過濾前的啤酒中懸浮的酵母數多,會直接影響啤酒可濾性。發酵過程中如果發生嚴重的酵母自溶,會導致啤酒pH上升、啤酒具有明顯的酵母味、酵母苦味;因高分子蛋白質分解產物進入到啤酒中,影響啤酒可濾性、非生物穩定性;因脂肪酸進入到啤酒中,影響啤酒口味、泡沫、口味穩定性;因蛋白質分解酶A進入到啤酒中,不利於純生啤酒的泡沫穩定性;避免酵母自溶是生產高質量啤酒的重要保證。
2.氮的代謝模式
啤酒酵母吸收麥汁中的氨基酸,不是靠簡單的濃度差的擴散作用,而是與酵母吸收可發酵性糖一樣,主要采用輕鬆式擴散吸收,並分為高、低親和載體兩種情形。
低親和載體:一般的氨基酸滲透酶,相對來說非專一性。
高親和載體:對某單個特殊氨基酸作用的滲透酶。
啤酒酵母不會直接同化麥汁中的氨基酸,用於本身酵母蛋白質的合成,而是在需要合成細胞蛋白質時,通過轉氨作用,形成所需的氨基酸。這說明酵母細胞是經濟合成,通過氨基酸的轉氨、脫氨作用形成酮酸,且產生需要量的α-酮酸,作為合成氨基酸的前驅物質。
(1)脫氨、轉氨反應被酵母氨基轉移酶(轉氨酶)催化而脫去氨基(—NH2),生成相應的酮酸同類物,再通過轉氨作用,由相應的酮酸同類物得到相應的氨基酸。
(2)合成核糖核酸小部分(10%~12%)構成酵母中的核糖核酸,維持酵母細胞的遺傳特征。
(3)當麥汁中的可同化氮含量低或某種氨基氮缺乏時,啤酒酵母可通過糖代謝產生酮酸,合成氨基酸。
3.氨基酸的代謝速率
啤酒酵母代謝(吸收)氨基酸,依賴於酵母細胞壁分泌一係列的氨基酸輸送酶調節。
(1)氨基酸的分類
①根據啤酒酵母利用速率分類:根據啤酒酵母吸收麥汁中某種氨基酸數量一半時所需時間,一般分成A、B、C、D 4類。酵母首先吸收A類氨基酸,啤酒酵母基本不吸收脯氨酸。
A(利用速率快):絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、穀氨酸、纈氨酸、胱氨酸(7種);
B(利用速率中):甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸(6種);
C(利用速率慢):酪氨酸、色氨酸、丙氨酸(3種);
D(利用速率極慢):脯氨酸(1種)。
②根據重要性分類:某些氨基酸的酮酸,對其他氨基酸合成非常重要,所以麥汁中必須含有充足的這類氨基酸,可忽視其他氨基酸對酵母整體的同化貢獻作用,也就是意義不大。所以可根據氨基酸在麥汁中的含量多少、對發酵的重要性分為不重要、重要和很重要三類。賴氨酸、組氨酸、精氨酸、亮氨酸是很重要的氨基酸。這是因為賴氨酸、組氨酸、精氨酸、亮氨酸所需的酮酸,必須由麥汁中相應的氨基酸提供,並不能通過糖代謝形成,所以,麥汁中缺乏這種氨基酸,必然改變酵母的蛋白質物質代謝,影響啤酒質量。而甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、色氨酸的濃度同樣重要,這些氨基酸在發酵初期含量較多,都在抑製糖代謝形成的酮酸途徑,一直進行到較晚的發酵階段時,麥汁中缺乏這些氨基酸,在發酵的後期會出現通過糖代謝形成酮酸,用於氨基酸的合成,如果這類氨基酸過低,也會對啤酒質量起負麵作用。其他不重要的氨基酸是因為在發酵的初期,能從糖代謝中形成此類氨基酸,過少也不會影響酵母進行氨基酸代謝,過多則殘留在啤酒中,又影響啤酒的爽口性。
(2)影響氨基酸代謝速率的因素
①酵母數量:數量多,作用快(與酵母繁殖密度有關)。
②酵母品種:一般來說上麵酵母和下麵酵母,基本按吸收氨基酸快慢的順序進行,但是某些下麵酵母會較晚吸收纈氨酸,Histidin、Arginin等酵母表現出無規則性吸收。
③氨基酸濃度:一般濃度高,作用快。
④氨基酸種類:種類多,作用快。
例如,兩種氨基酸同時存在,比一種作用速率增加10%;三種氨基酸同時存在,比兩種作用速率又增加8%;酵母利用氨基酸的順序受滲透酶的影響,A類和C類氨基酸存在競爭。因此不僅僅需要關注某些氨基酸的數量,而且還要控製可同化氮的數量。
⑤發酵時間:發酵時間長,作用數量多。
⑥發酵溫度:溫度高,作用數量多。
注意:如發酵溫度大於20℃(下麵酵母),酵母能代謝自身的蛋白質,產生自溶現象。如酵母在低溫0℃、長期保存、沒有營養時,也能代謝自身的氮,產生自溶,但較緩慢。
(3)α-氨基氮的代謝麥汁中蛋白質分解產物包括高、中、低分子氮。低分子氮的一部分能被啤酒酵母利用的,在實驗中可采用茚三酮檢測的一般以α-氨基氮(α-N)表示,12%的全麥芽生產的麥汁要求α-N含量220~240mg/L,適當較高的α-氨基氮含量,有利於酵母繁殖。
4.嘌呤、嘧啶等物質的作用
嘌呤和嘧啶等是構成細胞中核糖核酸和脫氧核糖核酸的重要物質。麥芽中含有0.2%~0.3%的核酸幹物質,糖化時受磷酸酯酶的分解,形成核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶等多種分解物,其中隻有嘌呤和嘧啶進入酵母細胞,構成核糖核酸、脫氧核糖核酸、三磷酸腺苷和某些輔酶。如果麥汁中缺乏嘌呤和嘧啶,會影響酵母的繁殖。一般來說,麥汁中不會缺乏需要的嘌呤和嘧啶。
三、發酵副產物的形成和分解
發酵期間通過酵母的新陳代謝形成了多種副產物,它們中的某些物質又被分解,這些發酵副產物同啤酒花成分、麥芽的某些成分一起對啤酒的口味和香味起著確定性的作用。因此,了解這些副產物的形成和分解十分重要。
衡量這些副產物對啤酒風味的影響,不僅僅要考慮它們在啤酒中的含量,也要考慮其本身的味閾值(單獨存在足以品出的濃度)。通過發酵副產物的風味強度(簡稱Fu)控製,可使啤酒風味協調,且啤酒中某種風味物質不會過於突出。
Fu=風味物質在啤酒中的濃度(mg/L)/風味物質的味閾值(mg/L)
Fu的大小,反映出某化學物質對風味的貢獻程度:
Fu>1.0,能明顯品嚐出該物質的風味,數值越高表示越強烈,如果不降低這類物質的含量,將嚴重改變啤酒的風味。
Fu在0.5~1.0,能感受該化合物的風味,但感受不明顯,如果不降低這類物質含量,會影響啤酒風味,但變化不嚴重。
Fu<0.5,該化合物對風味影響甚小或不會影響啤酒風味,隻能感受到綜合風味。
發酵副產物根據發酵時形成、是否能分解,對啤酒口味的影響可分為以下幾類。