miR—196a在下咽鱗狀細胞癌血漿中的表達及其臨床意義
論著
作者：鄔振華 李群 崔翔 沈誌森
[摘要] 目的 探討miR-196a在下咽鱗狀細胞癌（HSCC）患者血漿中的表達水平及其與下咽癌臨床因素的關係，明確miR-196a的診斷價值及臨床意義。 方法 利用57例臨床確診HSCC患者血漿配對樣本，健康體檢者血漿樣本50例，從血漿標本中提取總RNA，應用實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）方法檢測miR-196a在血漿中的表達水平，收集57例HSCC患者病理、臨床資料，統計分析血漿miR-196a水平和臨床病理特征的關係。構建受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），探討血漿miR-196a的診斷價值。結果 在HSCC患者中術前miR-196a的水平9.11（5.69，12.43）顯著高於術後12.69（9.16，14.84）及健康體檢者12.85（11.18，14.91）（P
0.05）。miR-196a血漿中的表達水平和分化程度（P0.05）。ROC曲線下麵積為0.755，截斷（cut-off）值為△Ct=10.84，95%CI：0.66～8.85 （P [關鍵詞] miRNA；下咽癌；腫瘤標誌物；診斷 [中圖分類號] R759.63 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）03-0011-05 下咽癌是耳鼻喉科常見惡性腫瘤之一，發病率有逐年上升趨勢，其中約95%為下咽鱗狀細胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC），多發生在梨狀窩、下咽後壁及環後區[1，2]。下咽癌起病隱匿，早期難以發現，多數下咽癌患者發現時已伴隨腫瘤浸潤、頸部淋巴結轉移，甚至遠處轉移，預後較差，主要治療方法包括手術、放化療、分子靶向藥物治療[2]。術後患者發音、吞咽功能均受到不同程度影響，5年生存率約31.4%[3]。因此，下咽癌患者的早期診斷，對患者的預後及生活質量影響起著至關重要的作用。但是目前沒有可靠的分子標誌物診斷下咽癌及預測腫瘤轉移，故探索下咽癌診斷分子標誌物十分重要。 通過分子生物學研究探索下咽癌的分子機製，為下咽癌的病因研究及診治提供了新方向。微小RNA（miRNA） 是一種內源性長度為22～25 nt的非編碼RNA，它可以通過特異性地與癌基因或者抑癌基因結合，在轉錄及轉錄後水平調控基因表達[4-5]，許多研究證明miRNA參與了腫瘤細胞增殖、分化、凋亡過程[4]。Mitchell等通過實驗證明miRNA能夠在血漿和血清中穩定存在，隨後大量研究者證明miRNA可以作為潛在的腫瘤診斷和預後評價的血液標誌物[6-8]。本研究通過檢測下咽鱗狀細胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC）患者及健康體檢者外周血中的miR-196a的水平，探討其在下咽癌的診斷中的作用。 1資料與方法 1.1 一般資料 收集2012年1月～2013年11月李惠利醫院經手術切除的57例下咽癌手術患者和50例健康體檢者血漿標本。下咽癌標本來源均為男性，病理診斷為HSCC；年齡43～81歲，平均60.1歲；術後病理按2002年UICC標準判斷下咽癌分期，組織類型及分化程度均由2名以上高年資病理醫師確診。57例下咽癌患者均無慢性肝病及肝、腎功能不全史。術前均未進行放化療，其中淋巴結轉移患者43例，影像學檢查未見有明顯的其他器官轉移灶。健康體檢人群無腫瘤病史，年齡40～79歲，平均60.5歲。下咽癌患者和健康查體人群的年齡、性別無統計學差異（P>0.05）。所有入組者均簽署知情同意書，並經過醫院倫理委員會批準。 1.2 試劑與儀器 MX3005P型全自動熒光定量PCR儀（Stratagene， USA）、NanoDrop2000分光光度計、Trizol LS 裂解液（Invitrogen， USA）、miScript Ⅱ逆轉錄反應試劑盒（miScript HiSpec Buffer， miScript Reverse Transcriptase Mix）（Qiagen，德國）、miR-196a 10×miScript Primer Assay（Qiagen，德國），Hs_RNU6B_2 miScript Primer Assay（Qiagen，德國）、定量PCR反應試劑盒（Qiagen，德國）。 1.3 標本采集 下咽癌患者的術前血液標本均在術前收集，術後1周收集空腹血液標本。收集後置於ETDA抗凝管中，所有血液自收集至處理時間不超過2 h。血液樣本在4℃下、3 000 r/min離心10 min；取上層血漿置於新的1.5 mL無RNA酶的離心管中，隨後在4℃下、12 000 r/min 離心10 min，獲取的血漿於 -80℃冰箱深度保存。 1.4 總RNA的提取 將臨床標本從超低溫冰箱中取出，取250 μL血漿置於2 mL離心管中並加入750 μL Trizol LS，反複吹打混勻，在4℃離心機中，12 000 r/min離心10 min後，吸取上清置於1.5 mL去RNA酶離心管中，加入200 μL三氯甲烷，旋渦震蕩20 s，然後在4 ℃，12 000 r/min離心15 min後吸取上層水相，加入600 μL異丙醇靜置，4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入1 mL 75%酒精，再次混勻。4℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清。置於室外幹燥 10 min，加入12 μL DEPC水溶解RNA並置於冰上備用。用NanoDrop 2000測定RNA濃度及OD值，OD260/OD280值在1.8～2.0之間的RNA樣品可用於逆轉錄反應。 1.5 實時熒光定量PCR 按照逆轉錄miScript II Reverse Transcription （RT）試劑盒說明書，將1 μg RNA加入逆轉錄反應體係轉錄為cDNA。反應條件為37℃ 1 h，95℃ 5 min。逆轉錄成功完成後，加入100 μL DEPC水備用。用5 μL cDNA為模板按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說明書加入10 μL 2×QuantiTect SYBR Green PCR混合物、1 μL 10×miScript通用引物、1 μL特異性引物、3 μL DEPC水配製20 μL反應體係。采用實時熒光定量PCR技術檢測特異性miRNA的表達水平，反應條件為：95℃預變性15 min，94 ℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，實驗重複3次。實驗結果用閾值循環數Ct（Cycle threshold）來表示，並采用U6小RNA為內參消除標本誤差，實驗引物均由Qiagen公司設計合成。特異性miRNA的相對表達水平用△Ct值表示，通過Mx3005P PCR System測出每個樣品的Ct值，通過公式：△Ct=（CtmiRNA-CtU6）計算△Ct值，△Ct值越高說明樣本中表達水平越低。 1.6 統計學處理 采用SPSS17.0 統計學軟件，數據均以中位數和四分位數間距表示，本文實驗數據樣本間變異偏大，故兩配對樣本組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗，臨床因素相關分組比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗，P 2 結果 2.1 實時熒光定量PCR法檢測miR-196a表達水平 HSCC患者術前血漿中miR-196a水平9.11（5.69， 12.43）顯著高於術後1周表達水平12.69（9.16，14.84），差異有統計學意義（u=-4.57，P0.05）。 2.2 下咽癌外周血血漿中miR-196a水平與臨床資料相關性分析 HSCC患者血漿miR-196a的水平與年齡（u=-0.36， P>0.05）、吸煙史（u=-0.60，P>0.05）等臨床因素無關，差異無統計學意義。HSCC患者血漿miR-196a水平與其淋巴結轉移相關（u=-3.78，P 2.3 miR-196a對下咽鱗狀細胞癌的診斷價值 通過構建ROC曲線並計算CI，探討miR-196a能否作為HSCC的診斷標誌物的意義。ROC曲線下麵積為0.755， cut-off值為10.84，95%CI為0.66～8.85（P 3 討論 血液檢測是患者住院檢查中的常規檢測項目，血液標本較組織標本更易於采集，且創傷小。甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖蛋白抗原153（CA-153）等血液腫瘤標誌物已廣泛用於臨床。有研究證明miRNA 可與腫瘤相關靶基因的3’非編碼區（untranslated regions，3’UTRs）結合並在轉錄水平使其降解，調節相關基因的表達，從而影響腫瘤發生、發展過程[9]。許多miRNA發揮著癌基因或者抑癌基因的作用[6-8]，並逐漸被用於腫瘤診斷並成為預後和療效評估的潛在標誌物[10]。通過檢測血漿中miRNA等腫瘤標誌物的表達水平，有利於為腫瘤早期篩查、診斷提供依據。 下咽癌發病率呈現上升趨勢，此病起病隱匿，病理類型多為中低分化鱗狀細胞癌。腫瘤的病理分期、臨床分期、淋巴結轉移程度是影響下咽癌預後的重要因素。許多miRNA參與下咽癌的發生、發展、轉移過程[11]。Orosz等[12]通過miRNA基因芯片技術構建下咽癌的miRNA表達譜，並證明miR-21、miR-143、miR-155在下咽癌中顯著高表達。Hsu等[13]收集包括HSCC在內的頭頸部鱗狀細胞癌的血漿標本後檢測發現miR-21水平在術前血漿標本中較高，且顯著高於術後血漿標本和健康對照組，提示miR-21是頭頸鱗狀細胞癌的新型的生物標誌物。同時Liu等[14]發現miR-21可以通過抑製PTEN基因表達參與下咽癌的發生過程。還有研究顯示miR-504、miR-451a在HSCC中發揮著抑癌基因的作用[15，16]。 miR-196a由MIR-196A1（17q21.32，RP11基因）和MIR-196A2（12q13.13，HOX基因簇）基因轉錄並加工形成成熟的miRNA。許多研究表明miR-196a在惡性腫瘤中高表達，如食道癌、胰腺癌、結腸癌、肺癌等[17-19]。Luthra等[17]實驗證明miR-196a在包括食道癌、子宮內膜癌、乳腺癌等在內的12種細胞係中高表達，通過抑製miR-196a的表達後，發現與細胞增殖、凋亡有關的膜聯蛋白A1和miR-196a的表達呈負相關。Slater等[20]通過對胰腺癌患者外周血中miR-196a的檢測發現，miR-196a在術前血中表達上調，腫瘤切除術後降至正常水平。Saito等[21]通過基因芯片技術篩選出喉癌組織標本的miRNA芯片表達譜發現，miR-196a在喉癌組織標本中高表達，通過大樣本實驗驗證芯片結果，並進一步研究證實miR-196a參與了喉癌細胞的增殖過程。目前關於血液中檢測miR-196a的相關研究不多，且尚缺乏miR-196a和下咽癌關係的研究，因此本研究結合病理臨床因素分析miR-196a在血漿中的水平和下咽癌之間的關係並研究其診斷價值。 本研究表明，下咽癌術前血漿miR-196a水平明顯高於術後，且顯著高於健康體檢者血漿水平。通過構建ROC曲線分析miR-196a的診斷價值發現，ROC曲線下麵積達0.755。吸煙是導致頭頸部腫瘤的致病因素之一[22]，腫瘤的臨床分期、淋巴結轉移及分化程度往往影響腫瘤患者的預後，因此本研究結合以上臨床因素進行相關性分析表明，血漿miR-196a水平和腫瘤的分期相關，晚期下咽癌血漿標本中的表達量顯著高於早期下咽癌患者血漿中miR-196a的水平（P 目前尚無特異性的下咽癌血液診斷標誌物，本研究將為今後下咽鱗狀細胞癌的診斷標誌物的研究奠定基礎，並為進一步探討下咽癌發生的分子生物學機製提供理論依據，miR-196a有望成為下咽癌診斷的潛在標誌物和基因治療靶點。 [參考文獻] [1] Cooper JS，Porter K，Mallin K，et al. 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