焦磷酸測序用於COL1A1基因多態性與骨肉瘤易感性關係分析
基礎醫學
作者：顏茂華 許斌 趙立來 朱求亮 羅建民 楊正明
[摘要] 目的 觀察骨肉瘤患者Ⅰ型膠原α1（COL1A1）基因多態性，探討骨肉瘤與COL1A1基因多態性的相關性。 方法 收集骨肉瘤以及正常患者外周血樣本，應用焦磷酸測序方法（Pyrosequencing）對54例骨肉瘤患者與126例健康對照者COL1A1基因rs1061970位點進行分析。 結果 54例骨肉瘤患者COL1A1rs1061970位點基因型頻率中，TT（13.0%）和CT（48.1%）要顯著高於正常對照組TT基因型頻率11.9%及CT等位基因頻率30.2%（P
0.05），但是骨肉瘤的發病風險仍呈上升趨勢。 結論 COL1A1基因多態性與骨肉瘤的發生具有相關性，攜帶COL1A基因T等位基因的發生骨肉瘤的風險增高。 [關鍵詞] 骨肉瘤；Ⅰ型膠原；基因多態性 [中圖分類號] R966；R979.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）03-0019-04 骨肉瘤作為好發於青少年的惡性腫瘤，手術方法多為廣泛切除或者截肢，導致致殘致畸，患者後續生活質量較差，故而早期預警、診斷以及治療變得異常重要。近年研究結果顯示，膠原在骨組織中除了對結構蛋白起到支持作用外，還可以深刻影響骨細胞的分化[1]、增殖[1]、粘附[2，3]以及形態發生[4]，而且和癌細胞的骨轉移也息息相關[5-7]。正常的骨組織中，90%的骨基質由Ⅰ性膠原構成，而軟骨中以Ⅱ型膠原為主。骨肉瘤發生時候，膠原的含量以及類型的變化可能影響骨肉瘤的分類、分化以及預後，有研究顯示[8]，Ⅰ型膠原的表達在不同分化水平的骨肉瘤中表達有顯著差異，因此，可作為骨肉瘤分化以及惡性程度判斷的參考標準。Ⅰ型膠原α1（COL1A1）基因主要編碼Ⅰ型膠原的α1鏈，是構成3股螺旋鏈不可或缺的一部分。該基因啟動子和UTR區域具有單核苷酸多態性（SNP），某些位點的SNP不僅引起單核苷酸堿基的改變，最後可導致蛋白表達和構象變化，這種變化目前已被證實可能與許多疾病密切相關，比如高度近視[9]、肝纖維化[10]、骨礦物質密度和礦物質轉換[11]以及椎間盤疾病[12]。骨肉瘤作為結締組織病的一種，相關的風險基因尚缺少係統研究，因此，對COL1A1基因多態性與骨肉瘤易感性關係的研究，將有助於更好地為提示患者患病風險提供預警。 1 資料與方法 1.1 臨床資料 於2008年1月～2013年12月期間，收集研究對象血液或石蠟切片。126例健康對照者來自我院體檢中心，其中男80例，女46例，年齡（25±10）歲。54例骨肉瘤患者來自我院骨科病房，其中男39例，女15例，年齡7～35歲，平均（20±10）歲，兩組患者年齡和性別的差異無統計學意義。骨肉瘤患者組納入標準為經過臨床、影像及病理學（穿刺或者組織活檢）確診為骨肉瘤；排除標準：有遺傳性腫瘤綜合征史。病理類型：骨母細胞、軟骨母細胞亞型 39例，纖維母細胞型及混合型 15例；腫瘤位置：上肢骨 16例，下肢骨 38例；Enneking GTM分期：ⅠA、ⅠB期 9例，ⅡA、ⅡB、Ⅲ期 45例；轉移：有轉移 14例，無轉移 40例；治療方式：截肢 18例，保肢36例。 1.2 DNA提取 每例研究對象取外周靜脈血4 mL或者取其石蠟組織切片。全血使用2%EDTA抗凝，運輸至實驗室後，常規苯酚-氯仿法提取DNA，所取DNA溶於TE溶液，檢測純度和含量。取部分DNA模板4℃冰箱保存備用，其餘的分裝後-20℃凍存，石蠟包埋樣本利用Qiagen公司QIAamp DNA FFPE Tissue試劑盒中提取說明進行，切片厚度在5 μm以上。 1.3 基因多態性檢測 COL1A1基因SNP檢測：采用聚合酶鏈反應結合焦磷酸測序（PCR-Pyrosequencing）方法進行COL1A1基因型檢測，COL1A1 rs1061970基因型，擴增含該多態位點的PCR引物序列為5′-TGT TCC TTT TTG TTC AAA GTC TAT-3′和biotin-5′-AAA ATT CAC AAG TCC CCA TCC-3′，測序引物為：5’-ttattccttgatattttttc-3’，產物為88bp。PCR反應體係為25 μL，包括Taq聚合酶1U，MgCl2 2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下遊引物各0.2 μmol/L，DNA模板。PCR條件為：95℃預變性3 min，然後94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s進行30個循環後，72℃延伸8 min。取適量PCR產物進行單鏈化，結合測序序列後使用SNP檢測通用試劑盒PyroMarkR. Gold Q96，用焦磷酸測序儀（PyroSequencer，Qiagen）進行檢測。每一批PCR反應均以蒸餾水替代DNA模板作為陰性對照，並隨機抽取10%的DNA標本進行二次分析以驗證分析方法的正確性。 1.4 統計學方法 根據 Hardy-Weinberg平衡定律（H-W平衡定律），按以下公式計算各基因型理論頻數：CC=np2，CT=2npq，TT=nq2，其中n為樣本量，p、q分別為相應的等位基因頻率，分別對骨肉瘤患者組及正常人群組分布進行SNP群體代表性檢驗。以χ2檢驗比較各基因型頻率在病例組與對照組之間的差異。以比值比（oddsratio，OR）及其95%可信區間（confidenceinterval，CI）表示各種基因型發生骨肉瘤的風險度。OR值以非條件Logistic回歸計算，並經性別、年齡狀況校正。統計學分析用SPSS 10.0版（SPSS Inc.， Chicago， IL）進行。 2 結果 2.1基因分型結果 COL1A1基因位於17號染色體上，具體位置為17q21。rs1061970 位於UTR區域的多態性，直接影響到翻譯的效率，COL1A1擴增產物片段長度為88 bp，利用帶biotin的引物擴增該片段後，製備成單鏈用於焦磷酸測序，該法簡便易行，操作簡單，可實現高通量檢測。檢測發現患者組合對照組基因型頻率和等位基因頻率分布符合H-W平衡定律，並且兩者頻率分布之間差異有統計學意義（P=0.04）。從而提示，COL1A1基因rs1061970位點多態性與骨肉瘤的發生有明顯相關。骨肉瘤患者與正常對照組COL1A1 rs1061970位點基因型分布和基因頻率比較經過H-W平衡檢驗在基因型頻率出現上無顯著差異。正常人群和骨肉瘤患者COL1A1基因多態性。經檢驗兩者在基因型頻率和等位基因頻率之間的差異有統計學意義（P 2.2 骨肉瘤患者 COL1A1基因多態性在各臨床亞組中的分布差異 隨後我們針對骨肉瘤患者不同基因型與臨床不同因素進行分層分析，結果顯示rs1061970位點與年齡、性別、病理類型、疾病的發生部位以及GTM分期差異均無統計學意義，而與患者有無轉移存在顯著差異，rs1061970位點三種基因型頻率分布與無轉移組的差異有統計學意義（P 3 討論 骨肉瘤是異質性比較強的疾病，其預後往往受到多種因素的影響，目前專門針對骨肉瘤預後的生物標誌物主要有APE1、VEGF、mTOR、EGFR、PARP1、OGG1、BRCA1、ERCC1、XRCC1等，但是由於潛在標誌物特異性不強，且多為基因表達分析，有一定波動性，因此，在一定意義上限製了臨床上應用，亟待探索其他相關標誌物，用於骨肉瘤的預後判斷。COL1A1基因也就是編碼Ⅰ型膠原α1亞單位的基因，不少研究提示該基因某些非編碼區域位點多態性可能和多種疾病有關，比如研究顯示和轉錄因子Sp1結合的位點多態性與絕經後婦女腕關節骨折有關[13]，從一定意義上證實這個基因SNP和骨代謝的關係。研究發現，COL1A1的多態性與骨肉瘤的易感性密切相關[14]，本研究從另一個角度揭示位點T與骨肉瘤的發生風險和轉移風險存在一定的相關性。COL1A1基因rs1061970位點基因多態性是由胸腺嘧啶核苷酸（T）替代咆嘧啶核苷酸（C）而形成，該區域處於3’-UTR位置，多態性存在可能影響翻譯的效率。本研究顯示，COL1A1基因3’UTR區域T→C的多態性在骨肉瘤患者以及正常對照中的基因頻率存在差異，進一步通過C和T分布頻率分析顯示，證實了 COL1A1 rs1061970位點的TC和TT，可能是風險性因素，存在這2個位點的患者骨肉瘤的易感性和轉移風險增加。而CC和CT，可能是保護性因素，但是兩組差異僅在SNP分布頻率上具有統計學意義，而C和T之間不具有統計學意義。該基因多態性可能調控著COL1A1基因的翻譯。我們也將臨床因素和該位點多態性進行關聯分析，結果發現該位點多態性主要與轉移有關，而和患者的病理類型、發生部位、年齡、GTM分期和性別都沒有顯著相關性，進一步說明TC和TT可能是骨肉瘤轉移的風險因素，後續對於該位點與骨肉瘤轉移的功能的深入分析，將為我們闡明COL1A1對骨肉瘤細胞轉移相關生物學功能的影響。此外，有研究顯示，在骨肉瘤患者的外周血中發現，存在COL1A1 mRNA高表達的患者[15]，最後都發生了轉移，在一定程度上提示，COL1A1的表達和患者預後存在負相關。然而，在肝癌中的研究中表現為COL1A1低表達的患者預後較差，並被認為是一個潛在的存活因子[16]。以上結果在一定程度上提示，COL1A1在不同腫瘤中對腫瘤預後的影響存在差異。因此，進一步研究將通過點突變的形式明確該位點變化對COL1A1表達的變化，以及通過大樣本人群的檢測探討COL1A1表達以及SNP變化和患者預後的相關性，並探討可能在上麵結合的轉錄因子位點，以期最後明確該基因位點多態性和骨肉瘤生物學功能的關係。 另外，本研究首次利用焦磷酸測序儀檢測COL1A1基因多態性和骨肉瘤相關性。焦磷酸測序可以用於SNP，甲基化以及未知序列的檢測，盡管讀長隻有5～60 bp，但是操作簡單，成本相對普通的一代和二代測序比較有優勢，現在已經有不少商品化的基於焦磷酸測序平台的試劑盒已經開發出來，比如EGFR、Kras的檢測試劑盒[17]，用於非小細胞肺癌替尼類藥物的伴隨診斷。因此針對若幹已知位點的快速檢測可以考慮焦磷酸測序平台，不僅可實現高通量而且單個樣本的檢測成本較有優勢。 在本研究中，也存在許多不足之處，由於骨肉瘤的發病率較低，本實驗中患者的樣本收集較少，研究的患者均來自同一所醫院，使得研究樣本有較大的局限性，實驗隻有1個位點，應該在不同地區和種族中進行大樣本數據分析，並聯合多個SNP位點進行多中心研究，以最終明確COL1A1基因多態性與骨肉瘤的敏感性。 [參考文獻] [1] Cheng Y，Ramos D，Lee P，et al. Collagen functionalized bioactive nanofiber matrices for osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells： Bone tissue engineering[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology，2013，（2）：287-298. [2] Teixeira S，H. Fernandes M，P. Ferraz M，et al. Proliferation and mineralization of bone marrow cells cultured on macroporous hydroxyapatite scaffolds functionalized with collagen type I for bone tissue regeneration[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A， 2010，（1）：1-8. [3] Kuo Y C，Yeh C F. Effect of surface-modified collagen on the adhesion，biocompatibility and differentiation of bone marrow stromal cells in poly（lactide-co-glycolide）/chitosan scaffolds[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2011，82（2）：624-631. [4] Liu L，Qin C，Butler W T，et al.