第一節 實驗動物的胚胎工程
實驗動物學是現代生命科學的重要組成部分，隨著生命科學的不斷發展，現代實驗動物學已經從過去隻注重實驗動物的飼養管理和實驗操作的宏觀向綜合了整體水平、細胞水平和分子水平的微觀方向發展。胚胎工程是指運用人工方法對動物的胚胎及配子進行操作和改造，是改良動物品種、品係，保存動物種子資源及轉基因動物的重要手段。20世紀後期，胚胎工程技術得到了迅速發展，現有技術體係主要包括：胚胎移植相關技術、胚胎分割與胚胎嵌合、胚胎幹細胞技術等。其中胚胎移植相關技術又包括排卵控製、體外受精和顯微受精、胚胎培養、胚胎保存、胚胎移植等。胚胎工程技術對於實驗動物的遺傳育種、種子保存，以及超純係實驗動物的培育具有重要的理論意義和實際應用價值。
一、胚胎移植相關技術
（一）胚胎移植
胚胎移植（embryo transfer）是一項難度較高的顯微操作過程，是胚胎工程的重要基礎。經胚胎生物技術處理的胚胎，必須實施胚胎移植才能達到目的，如轉基因動物生產、孤雌生殖等。胚胎移植的技術程序包括供體的超數排卵、受體的同期發情、胚胎采集、胚胎的評定、胚胎的保存與培養、胚胎移植等步驟。1890年，英國劍橋大學的Walter Heape 首先獲得兔胚胎移植的成功。他將分裂至4細胞期的安哥拉兔的早期胚胎移植到已經進行交配的比利時母兔的輸卵管內，結果得到了6隻小兔，其中2隻具有長毛、白化等安哥拉兔的特征。隨後，小鼠、大鼠及多種哺乳動物的胚胎移植均獲得成功，我國也對兔進行了比較係統的胚胎移植研究。
胚胎在發育的最初階段將於4天內由一個細胞分裂至16個細胞，隨後依次發育成為桑葚胚、胚泡和囊胚。按照胚胎發育階段不同，移植部位也不同，胚胎移植據此分為輸卵管移植和子宮移植。原核胚胎到8細胞期前的胚胎進行輸卵管移植，8細胞期後的胚胎進行子宮移植。輸卵管移植技術難度較大，以大鼠為例，進行輸卵管移植時，一般是找到輸卵管傘口，將移卵管從輸卵管傘口插入。子宮移植的技術難度不大，較易掌握。按照操作方法，胚胎移植又可分為手術法和非手術法。對於小型實驗動物常采用手術法；非手術法常用於牛、馬等大動物，一般使用類似於人工授精的專用輸胚槍，直接插入排卵側子宮角內注入胚胎。
胚胎移植對於生產SPF級實驗動物、培育實驗動物、保存品種資源以及加強國際交流等具有重要意義。
（二）排卵控製
排卵控製是通過對雌性動物采用外源激素處理，改變其性周期和排卵數來實現的。國內外排卵控製研究中常用到的效果較好的激素有促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）。其中FSH 生物功能是刺激卵巢中卵泡的成熟並分泌雌激素；LH 也稱促間質細胞激素（ICSH），其生物功能是激發排卵，促使黃體從萎縮破裂的卵泡中形成並分泌雌激素和孕激素；PMSG 可以促進雌性動物卵泡的發育、排卵及黃體的形成；hCG 也可促進卵泡發育和排卵。實際應用中，常把FSH 和LH，hCG 和PMSG 配合使用，可取得較好效果。
哺乳動物的排卵控製包括排卵時間的控製與排卵數量的控製。通過排卵時間的控製，可以得到特定胚齡的卵子，以供研究用，例如，轉基因使用的原核胚。排卵數量的控製又稱為超數排卵（super ovulation），其目的是為了獲得更多的卵子。一般來說，6～18周齡的雌性小鼠和8周齡以上雄鼠自然交配，選擇見到陰道栓（plug）的雌鼠，可獲得7～13個受精卵。而經超數排卵處理之後，可以得到高於正常排卵量數倍的卵。例如，實驗兔正常情況下平均每次排卵9枚，通過超排，曾有1隻兔一次獲得88枚胚胎；KM小鼠平均每次排卵8枚左右，經超排處理，曾有1隻KM 小鼠一次獲得83枚胚胎。研究發現，不同品係小鼠超排效果不同。近交係小鼠C57BL/6J、CBA、129/SVJ、CBA/H、SJL/J、C58/J的超排效果要比BALB/cJ、C3H/HeJ、A/J、129/J、DBA/2J好。前者每隻小鼠可收集40～60個卵，後者隻有15個左右。
在生產中，應用超數排卵-胚胎移植（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）技術，可迅速擴大目的種群的後代數量，加快遺傳進展。同時，滿足胚胎工程、遺傳工程研究及建立胚胎庫的需要。
（三）體外受精和顯微受精
1.體外受精體外受精（in vitro fertilization，IVF）是成熟卵細胞與經過處理的精子在體外結合而發育成合子的過程。體外受精的合子經過體外或者異種動物體內培養，再移到同種動物體內妊娠產仔，由此得到的動物稱為試管動物。
早在1878年，德國科學家Schenk 就開始進行哺乳動物卵子體外受精的嚐試。他將排卵前的卵母細胞和附睾內精子放入子宮液內進行孵育，觀察到第二極體釋放和卵裂現象。但是直到20世紀40年代，世界上也隻有為數不多的科學家能成功地進行哺乳動物體外受精實驗。1951年，美籍華人張明覺（Chang M。C。）和澳大利亞的Austin 幾乎同時發現隻有在雌性生殖道停留一定時間的精子才能成功地與卵子結合，進行體外受精。Austin 於次年將這種現象命名為獲能（capacitation）。從此以後，體外受精研究蓬勃開展起來。
自1959年Chang 利用獲能處理的精子進行體外受精實驗獲得第一例試管動物試管兔以來，目前已經有近20種實驗動物體外受精取得成功，在小鼠、大鼠、兔、恒河猴等多種動物獲得了後代。1964年，Yanagimachi 和Chang 以金黃倉鼠為實驗材料的研究解決了以前精子獲能須通過若幹繁瑣而經驗化的步驟的問題，開創了在簡單培養液中進行獲能處理的方法，大大加快了體外受精技術的發展。國內體外受精研究取得成功的例子有：小鼠（1987年，中科院遺傳所）、牛和綿羊（1989年，內蒙古大學）、兔（1990年，西北農業大學）、山羊（1991年，西北農業大學）。
（1）卵母細胞的體外成熟卵母細胞的體外成熟和精子的體外獲能是體外受精的基礎。卵母細胞減數分裂成熟是指長足（fully grown）的卵母細胞向成熟卵子轉化的過程。長足的卵母細胞在體外可不依賴於激素而自發成熟，而且體外培養條件下卵母細胞發生生發泡破裂、紡錘體形成等事件的時序與體內觀察到的一致。因此，卵母細胞的體外成熟一方麵可以為體外受精提供大量的可利用卵母細胞，另一方麵也為卵母細胞的體內成熟提供了結構和生化研究的理想模型。卵母細胞的體外成熟主要包括減數分裂的恢複和完成，以及細胞質、細胞膜、透明帶、卵丘細胞的成熟變化。以小鼠為例，在體外培養幾小時後卵母細胞完成生發泡破裂，此間同時發生染色體凝集；培養6h後，出現形態明顯的減數分裂紡錘體，9h後則十分清晰；體外培養10～13h後，在紡錘體區伸出一突起並最終形成第一極體。隨後末期中間體（包繞末期紡錘體的中間區域的嗜堿膜囊環）形成，極體脫離開始。
卵母細胞體外成熟受到多種因素影響，如動物種類、年齡、培養條件等。小鼠、大鼠和人的卵子比較透明，可借助一般實體或相差顯微鏡觀察卵母細胞是否發生了生發泡破裂，以此判斷卵母細胞是否成熟。
（2）精子的發生與體外獲能精子是在睾丸中發生、變態並進一步在附睾中成熟而獲得正常受精能力的。精原細胞經數次有絲分裂後形成初級精母細胞，後者再經一次分裂形成次級精母細胞。隨後次級精母細胞在完成第二次減數分裂後形成單倍體的球形精子細胞，球形精子細胞發生變態，脫離曲細精管，依次經過附睾頭、附睾體和附睾尾，最終發育成為成熟精子。處於不同發育時期的生精細胞，由於其成熟度不同，所以受精潛力也有所差別。常規體外受精多采用成熟度較高的附睾尾和射出的精子。
體外受精所用的精子在大、中型動物可采用人工按摩或電刺激法獲得，小型動物需用手術法從附睾獲得。卵子來源有2種方法，小型動物係采用超數排卵處理，從輸卵管采集體內成熟卵子；或采用手術方法，從卵巢上采集未成熟卵子進行體外成熟。牛、羊等大中型動物可進行活體采卵或從屠宰後動物的卵巢獲得。
體外受精之前，精子必須在雌性生殖道或體外培養液中停留一段時間，才能具備受精能力。精子體外獲能是體外受精技術中的關鍵環節之一，可受到多種因素的影響，如孵育溫度、動物種類、采精位置、培養液組成等。目前人工獲能已有很大進展，特別是家畜中牛精子的人工獲能，各國研究者已發展了一係列有效方法。獲能過程總體包括2個步驟，精子的洗滌和特定成分誘導精子獲能和頂體反應。
精子活力是一項十分重要的指標，是精子在雌性生殖道運行並成功受精的前提。為了獲得活力較強的精子，常常對精子進行一些預處理。浮遊（swim up）技術是體外受精中普遍采用的步驟，該程序一般是將洗滌後的精液放入適當的浮遊溶液中，在培養箱中靜置30～60min，這期間運動力較高的精子浮遊到浮遊溶液中。實驗中也有省略精子浮遊步驟的。其他處理方法，如潛遊（swim down）技術、玻璃棉（glasswool）過濾、BSA/Percoll 密度梯度等方法，均可獲得質量較高的精子。
除了通過對精子進行預處理來分離出高活力的精子外，也可以通過添加一些化學試劑來刺激精子活力並保持之。咖啡因可通過抑製環核苷酸磷酸二酯酶而導致細胞內cAMP 的積累。1988年，Pomeroy 等發現咖啡因能通過提高小鼠精子活力而提高受精率。其實驗顯示咖啡因還能提高頂體反應、精子結合透明帶的能力以及精子與卵膜的融合能力。腺苷和它的類似物（2-氯腺苷和2-脫氧腺苷）可刺激cAMP 產量而提高精子活力。PHE 是青黴胺（penicilliamine）、亞牛磺酸（hypotaurine）和腎上腺素（epinephrine）的混合物，有研究顯示在體外受精培養液中添加PHE 可顯著提高精子活力和穿卵率，但也有人認為用PHE 沒有什麼明顯效果。其他能提高精子活力的物質還有血小板激活因子（PAF）、穀胱甘肽（GSH）、己酮可可堿（pentoxifylline）和茶酚（theophylline）等。
（3）體外受精中的重要因素溫度和氣相是體外受精中的重要因素，很小的溫差就可能對體外受精造成很大影響，配子和胚胎必須置於嚴密控製的氣相中（例如含5%CO2的空氣，或5%CO2+5%O2+90%N2），並且用100%濕度避免培養液的蒸發。同時還應注意，培養箱以外的操作，如精子浮遊、洗滌和卵子上卵丘細胞的去除等，應盡可能快地進行。另外，受精液應能提供精子穿卵的正常條件。1977年，Bavister 和Yanagimachi 在倉鼠體外受精研究中配製出TALP 液，該液包括m-Tyrode’s 液、0.6%BSA、乳酸鈉和丙酮酸鈉。後有人將TALP 液引入到牛的體外受精中，取得了良好的效果。
目前製約體外受精技術發展的因素還有很多。在體外培養的卵母細胞的細胞質是否真正成熟不僅影響到受精，而且對卵裂及胚胎發育甚至著床和出生後也有較大影響，應在培養條件上進行更多研究。多精子受精可導致正常發育率低，通過調整精子濃度或受精時間對其進行控製的技術還需進一步完善。體外受精的胚胎在體外發育至一定階段時會發生退行性變化，即發育阻滯（block），不同動物發生發育阻滯的階段亦不同。人胚胎發生在晚4至早8細胞期，小鼠發生在2細胞期，牛和綿羊發生在8到16細胞期。胚胎發育阻滯可能是由於培養條件的不完善引起的，運用共培養或在培養液中添加特殊成分可使一部分胚胎通過發育阻滯階段繼續發育。
2.顯微受精顯微受精（microfertilization）技術是20世紀80年代後期發展起來的通過對動物配子進行顯微操作以使其受精的技術。它是在體外受精的基礎上，隨著顯微操作技術和設備的不斷發展和完善而出現的。
最早報道顯微受精的是Hiromoto，1962年，他發現向爪蟾的卵母細胞中注射同種或異種精子均可形成雌雄原核，並且注射過程能激活卵母細胞。除此之外，最早進行顯微受精研究的還有Uehara 和Yanagimachi，他們發現將倉鼠的精子顯微注射到倉鼠的卵母細胞內可以形成雄原核，並可以完成早期胚胎發育。此後，Thadani、Perreault、Zirkin等對大鼠、小鼠精蛋白的生化性質、DNA 合成對顯微受精的影響等做了大量的基礎研究，對顯微受精技術的完善和發展起到了重要作用。1988年，Iritani 和Mann 分別報道了兔單精子胞質內受精和小鼠單精子帶下受精獲得後代。後有研究者用不活動的兔精子注射到卵母細胞質內也獲得了後代。1993年，我國獲得了首例顯微受精仔兔，隨後在用小鼠附睾精子、球形精、次級精母細胞乃至初級精母細胞進行卵細胞質內注射均獲得了正常發育的小鼠後代。
（1）顯微受精技術的基本操作方法顯微受精技術目前有透明帶鑽孔（ZPD）、透明帶帶下注射（SUZI）和卵細胞質內注射（ICSI）等方法。為方便精子進入卵母細胞，在透明帶上鑽開或打開一個小孔即透明帶打孔技術。這種技術目前已經基本被淘汰，隻是有時作為輔助手段，在生精細胞顯微受精中還會用到。透明帶帶下注射法是將一個或多個精子注入卵周隙，這是在透明帶鑽孔技術的基礎上，為了控製多精受精而采用的方法。事實證明，精子帶下注射數量是此項技術成功的關鍵。胞質內注射法是將精子直接注入卵母細胞質以完成受精過程的方法。這種方法對卵母細胞的損傷大於透明帶帶下注射法，同時其正常受精率顯著高於透明帶帶下注射法，但這種方法往往比透明帶帶下注射法產生更多的三倍體胚胎。可見2種方法各有優缺點，一般活動精子多選擇透明帶帶下注射法，而死的或不完整的精子則選擇胞質內注射法。這是因為卵細胞質內注射可解除精子穿入透明帶和精卵質膜融合的雙重屏障作用。因此，進行卵細胞質內注射時對精子的活動能力不做要求。研究顯示，即使是死的、不完整的精子注射之後也能產生後代。