第一節 免疫學研究中的動物實驗方法
一、動物免疫血清的製備
免疫血清的製備是一項常用的免疫學實驗技術，高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑，也可供特異性免疫治療用。
（一）動物的選擇
選擇合適的動物進行免疫極為重要。用於免疫的動物應適齡、健康、無感染性疾患，常用的有兔、山羊和豚鼠等。選擇免疫動物時應考慮：①抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好，若親緣關係太近則不易產生抗體應答；②抗血清量的需要；③抗血清的要求；④抗原的選擇。此外，還需重視動物的飼養，以消除動物個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。
（二）佐劑
由於不同個體對同一抗原的反應性不同，而且不同抗原產生免疫反應的能力也有強弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質，以刺激機體產生較強的免疫反應，這種物質稱為免疫佐劑。
佐劑能延長抗原在體內的存留時間，增加抗原刺激作用，還能刺激網狀內皮係統，使參與免疫反應的免疫活性細胞增多，促進T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產生。
（三）免疫劑量、時間和途徑
製定不同抗原的免疫血清的程序各不相同，應選擇合適的免疫原劑量、免疫途徑和免疫間隔時間。
1.免疫原劑量免疫原劑量的選定應考慮抗原性強弱、相對分子質量大小和免疫時間。抗原需要量多，時間間隔長，劑量可適當加大。
2.免疫途徑免疫途徑有多種多樣，如靜脈、腹腔、肌內、皮內、皮下、淋巴結注射等，一般常用皮下或背部多點皮內注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定於抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。
3.免疫間隔時間免疫間隔時間也是重要因素，特別是首次與第2之間更應注意。一般以間隔10～20天為好。2次以後每次的間隔一般為7～10天，不能太長，以防刺激變弱，抗體效價不高。半抗原需經長時間的免疫才能產生高效價抗體，有時總時間為1年以上。
（四）動物采血法
動物免疫3～5天後，如抗血清鑒定合格，應在末次免疫後5～7天及時采血，否則抗體水平將會下降。因故未及時取血，則應補充免疫一次（肌內、腹腔或靜脈注射，不加佐劑），過5～7天取血。動物常用采血方法如下。
1.頸動脈放血法這是最常用的方法，對兔、山羊等動物皆可采用。具體操作如下：在動物頸外側做皮膚切口，拉開皮膚後可見斜行的胸鎖乳突肌，將此肌鈍性分離並推向後方，即可見到淡紅色有彈性的頸動脈。將此動脈輕輕遊離（連同與之同行的迷走神經），用絲線將遠心端結紮，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾住動脈迷走神經，用以固定。沿結紮處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端放入瓶口，慢慢打開夾持的止血鉗，動脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快，動物死亡也快，取血量略少於其他放血法。如在放血大約總量的一半時，暫時將動脈夾住片刻，再繼續放血，得血量可以多些。
另外一種慢放血法是在動脈內插入一采血器，用閉式放血。在頸動脈內插入一較粗的玻璃管，將血管與玻璃管用線紮牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也極為方便。
2.心髒采血法此法多用於豚鼠、大鼠、雞等小動物。取血前應探明心髒搏動最強部位，通常在胸骨左緣的正中，選心跳最顯的部位做穿刺。針頭宜稍細長些，以免發生手術後穿刺孔出血，采血技術應熟練，穿刺不準容易導致動物急性死亡。
3.靜脈多次采血法兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日1次，有時可采集多量血液。如用耳靜脈切開法，1隻兔可采百餘毫升血液（用頸動脈放血最多可獲70～80ml，一般隻有50ml左右）。用頸靜脈采集綿羊血，一次可放300ml，放血後立即回輸10%葡萄糖鹽水，3天後仍可采血200～300ml。動物休息1周，再加強免疫1次，又可采血2次。如此，1隻羊可獲1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取斷尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超過2ml。
抗血清的分離多采用室溫自然凝固，然後放置37℃或4℃待凝塊收縮。
（五）免疫失敗的可能原因及應采取的措施
有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方麵找原因，並改進之。
1.動物種屬免疫動物的種屬及品係是否合適，可考慮改變動物的種屬或品係，或擴大免疫動物的數量。
2.抗原質量抗原質量是否良好，可改用其他廠家的產品或改用同一廠家的其他批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。
3.免疫原製備的免疫原是否符合要求，可從偶聯劑、載體、抗原或載體的比例、反應時間等多方麵去考慮，並加以改進。
4.佐劑所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其他佐劑，或加強乳化。
5.實驗方法免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。
6.動物飼養動物飼養是否得當，如營養（飼料、飲水）、環境衛生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。
二、單克隆抗體的製備
單克隆抗體是由單個克隆B細胞產生的，在分子上是同質的抗體。1975年Kohler和Milstein創立了單克隆抗體雜交瘤技術。克隆抗體的製備方法如下。
（一）動物的選擇與免疫
1.動物的選擇多選用純種BALA/C小鼠。
2.免疫方案選擇合適的免疫方案對於細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前2個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先製備免疫原，再加佐劑。免疫途徑如下：初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml，0.2ml/點）；3周後，第2次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或腹腔內注射（劑量不宜超過0.5ml）；3周後，第3次免疫劑量同一，不加佐劑，皮下（5～7天後采血測其效價；2～3周，加強免疫，劑量50～500μg為宜，皮下或靜脈內注射；3天後，取脾融合。
（2）顆粒抗原顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為（1～2）×107個細胞。初次免疫1×107/0.5ml 皮下注射，2～3周後，第2次免疫1×107/0.5ml 皮下注射。3周後，加強免疫（融合前3天）1×107/0.5ml 皮下注射或靜脈注射，取脾融合。
（二）細胞融合
1.細胞融合前準備
（1）骨髓瘤細胞係的選擇骨髓瘤細胞應和免疫動物屬於同一品係，這樣雜交融合率高，也便於接種雜交瘤在同一品係小鼠腹腔內產生大量McAb。骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640、DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以（104～105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處於對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代1次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。
（2）飼養細胞在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其他活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在製備McAb的過程中，許多環節需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾髒細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞係3T3經放射線照射後作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。
2.細胞融合的步驟
（1）製備飼養細胞層一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。與免疫小鼠相同品係的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周。拉頸處死，浸泡在75%乙醇內，3～5min，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜。用注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管），反複衝洗，吸出衝洗液。衝洗液放入10ml離心管，1200r/min，離心5～6min。用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml。加入96孔板，100μl/孔，放入37℃CO2孵箱培養。
（2）製備免疫脾細胞最後一次加強免疫3天後，小鼠拉頸處死，無菌取脾髒，用培養液洗1次，將脾髒研碎，過不鏽鋼篩網，離心，細胞用培養液洗2次，計數，取1×108脾淋巴細胞懸液備用。
（3）製備骨髓瘤細胞取對數生長骨髓瘤細胞離心，用無血清培養液洗2次，計數，取得1×107細胞備用。
（4）融合
1）將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，1200r/min，離心8min；棄上清液，用吸管吸淨殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。
2）90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（相對分子質量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。
3）加37℃預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
4）離心，800r/min，6min。
5）充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。
6）將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl，一般一個免疫脾髒可接種4塊96孔板。
7）將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。
（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測
1.HAT選擇雜交瘤細胞脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理後，形成多種細胞的混合體，隻有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由於骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述2種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。
在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天後瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天後應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10麵積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞係。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。
2.抗體的檢測檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：放射免疫測定（RIA）可用於可溶性抗原、細胞McAb的檢測；酶聯免疫吸附實驗（ELISA）可用於可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測；免疫熒光實驗適合於細胞表麵抗原的McAb的檢測；其他如間接血凝實驗、細胞毒性實驗、旋轉黏附雙層吸附實驗等。
（四）雜交瘤細胞的凍存與複蘇
1.雜交瘤細胞的凍存及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞係的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的汙染、分泌抗體能力的喪失等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞係的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。
細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞碸）。凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃後放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期複蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。
2.細胞複蘇方法將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌2次，然後移入前一天已製備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。
（五）單克隆抗體的大量生產
1.體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml，如果大量生產，費用較高。
2.體內接種雜交瘤細胞，製備腹水或血清
（1）實體瘤法對數生長期的雜交瘤細胞按（1～3）×107/ml接種於小鼠背部皮下，每處注射0.2ml，共2～4點。待腫瘤達到一定大小後（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆抗體的含量可達到1～10mg/ml，但采血量有限。
（2）腹水的製備常規是先腹腔注射0.5ml Pristane或液體石蠟於BALB/C鼠，1～2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天後可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠瀕於死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一隻小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反複收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，複蘇後轉種小鼠腹腔則產生腹水快、量多。
三、移植性腫瘤整體動物模型的製備
把人的腫瘤細胞通過合適的方法移植到適合的宿主體內，建立一個移植宿主的體內模型，通過該模型對受試物進行觀察。
（一）移植宿主的選擇
在腫瘤移植模型的建立中，移植宿主的選擇非常重要，如果沒有適宜的移植宿主動物，腫瘤移植模型就難以建立，此外，還應該考慮移植宿主對腫瘤傳代保種的影響。
目前常用的宿主動物主要裸小鼠和C57BL/6小鼠。這2種動物為國際所承認，裸小鼠是一種較為理想的動物，該鼠先天性無毛，無胸腺，T淋巴細胞功能缺乏，對異種移植不產生排斥反應，用來移植人體腫瘤組織塊的癌細胞成功率高。但價格昂貴，飼養時對實驗室的條件要求高，小鼠不易大量繁殖。C57BL/6小鼠是一種黑毛，體形小的小鼠，它性情較溫馴，易於飼養管理，費用適中，飼養條件不高，容易大量繁殖，因此常用於受試物的篩選研究。
（二）腫瘤細胞的來源與保存
通常人體腫瘤細胞的來源大致可分為2類，一類是人的癌細胞株；另一類是源於人體腫瘤組織塊的癌細胞。為了使腫瘤細胞能得到長期使用和保持不同代的腫瘤組織的本來特性，防止退化或變異，對腫瘤細胞的冷凍保存是很必要的。一般情況下，液氮凍存1～2年後，細胞存活率可達80%～90%，有的可存活時間更長。