1516年波蘭國內戰事不斷，在烽火連天的日子裏，哥白尼開始撰寫他的不朽之作《天體運行論》。1519年，哥白尼辭去所有職務準備專心寫書，但很快戰爭就席卷到弗隆堡，哥白尼被迫中斷了寫作，和居民一起參加了堅守城堡的戰鬥。一直到1525年秋天，哥白尼寫作《天體運行論》的工作才全力展開。這本書的第一卷介紹了宇宙的結構，哥白尼列舉了許多觀測實例證明了地球是球形的。他認為所有物體都傾向於將自己凝聚成球狀。物體呈球狀的原因在於重量，要把自己凝聚成一個整體，並收縮成球狀。他的這種觀點為一百多年後牛頓發現萬有引力開辟了道路。第一卷是全書的精髓。哥白尼論述了“日心學說”的核心問題，即地球的運動及其在宇宙中的位置。他正確地闡述相對運動的概念，提出日月星辰的周日運轉是地球自轉所引起的視運動。他有力地批駁了“地心學說”。哥白尼還排列出“天球”的次序，他由長期的行星觀測結果，正確地排列出它們和地球繞太陽運轉軌道的順序。書中刊載了一張運行圖，它標誌著人類認識宇宙的一次飛躍。第一卷的最後詳細講解了球麵三角學的基礎知識。這本書的第二卷論述了地球的三種運動（自轉、公轉和赤緯運動）所引起的一係列現象，後半部分哥白尼講述了恒星方位與亮度的測定及星表的編製。第三卷主要論述歲差現象，他提出歲差是由地球自轉軸方向的變化引起的。因為這個現象很複雜，他用一些圖形來闡明自己的理論。第四卷中哥白尼專門討論月球的運動。哥白尼很重視對月球的研究，他已認識到月球的運動與地心有最密切的關係。哥白尼對月球的觀測比前人精確得多。書中占最大篇幅的第五卷和第六卷都是論述行星的運動的，第五卷討論行星的經度行度，第六卷討論它們的緯度行度。哥白尼根據相對運動的原理，解釋了行星運動的視運動。在哥白尼之前，這一原理從來沒有被人詳盡地闡述過，也沒人從這一原理中得出這樣重要的結論。哥白尼還論證說：“地球雖是一個巨大的球體，但比起宇宙來卻微不足道。”他證實了宇宙無限的論斷。
他說：“根據這一論斷，可見宇宙跟地球相比是無法測度的，它是一個無邊無垠的龐然大物。”哥白尼用科學的太陽中心說，推翻了在天文學上統治了一千多年的地球中心說，這是天文學上一次重大的革命，《天體運行論》這部偉大的著作使人類的宇宙觀產生了巨大變革。
16世紀30年代後期，《天體運行論》一書已接近完成，哥白尼卻遲遲不願出版這本書。他確信自己的學說是正確的，但他擔心由於傳統偏見的作用，讀者難以接受。他更擔心教會對科學和進步思想的瘋狂迫害。當時教皇為了鞏固封建統治，宗教裁判所燒掉了許多珍貴的科學著作，有時一天竟燒掉20大車書。1327年，意大利天文學家采科·達斯科裏被活活燒死，他的“罪名”就是違背聖經的教義，論證地球是球狀，在另一個半球上也有人類存在。哥白尼曾親眼目睹了宗教裁判官對異教的鎮壓。哥白尼也經常受到威脅和迫害，直到他臨終時身邊還有上司所布置的密探和奸細。這一期間，羅馬教廷對於哥白尼的學說也感驚慌，教皇曾讓人給自己講了“太陽中心學說”的基本原理，聽後他大為震驚，於是他想把哥白尼的手稿控製起來。正當教廷急於索要他的手稿，哥白尼遲疑不決時，他的朋友和學生協助他搶在教廷插手之前開始付印出版這本書。
負責這本書出版事宜的出版商奧西安德爾，抽掉了哥白尼親筆寫的序言，按照自己的意願寫了一篇沒有署名的序言。這篇序言宣布“日心學說”不是什麼真理而是一種假設，一種臆斷。這和哥白尼的原序觀點完全相反。哥白尼對奧西安德爾的這篇偽撰的序言是如何反應的，現在已難考證，因為很可能在《天體運行論》一書出版之際，哥白尼已重病在身處於昏迷狀態了。他的學生雷蒂庫斯堅信哥白尼是絕不會同意這篇偽序言的觀點，他說哥白尼不會說含含糊糊、吞吞吐吐的話，他要使宇宙的真相大白於天下，地球確實是繞著太陽旋轉的。1543年，在哥白尼彌留之際，這部書才出版問世。據說，剛剛印好的書送到哥白尼麵前時他隻用顫抖的手撫摸了一下這本書就與世長辭了。