酶標法的優點為:①酶標抗體相對分子質量小,穿透組織能力強,敏感性高,適用於包埋前法;②其方法與免疫酶組織化學方法相同,能很好地進行光鏡與電鏡的對比觀察;③酶標抗體的穩定性好,可應用SPA法、PAP法或ABC法以提高其敏感性。其不足之處為:①反應最終產物鋨黑的電子密度較金屬標記物低,不宜用醋酸鈾和枸櫞酸鉛作對比染色,因此組織的超微結構不夠清楚;②用於抑製內源性辣根過氧化物酶活性的H2O2會破壞抗原和細胞的超微結構。
二、操作方法
(一)包埋前法 即先做免疫組化染色,再按常規電鏡檢查要求進行脫水、包埋、超薄切片和電鏡觀察。其優點為:①由於先做免疫組化染色,組織內抗原破壞較少,易獲成功;②適用於冷凍切片、振動切片機切出的厚片、生長在蓋玻片上的培養細胞以及細胞懸液和塗片;③可進行光鏡和電鏡的對比定位觀察;④可根據免疫組化染色結果選材後再做免疫電鏡觀察,陽性檢出率高。其缺點主要為免疫試劑不易穿透厚組織片,因此其一般采用酶標記法,並需采取一些增強抗體穿透性的措施。
1.取材 其與普通電鏡取材方法相同。
2.前固定 其目的是既要保存好細胞的超微結構,又要盡可能保持待測抗原結構不受破壞,但要兩者兼顧常十分困難。目前較為常用的固定劑有:
(1)多聚甲醛-戊二醛固定液(paraformaldehyde-glutaldehyde,PG):多聚甲醛的濃度一般為1%~4%,戊二醛的濃度一般為0.01%~0.5%。一般需在4℃下固定2~10小時。
(2)過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液(periodate-lysine-paraformaldehyde,PLP):一般需在4℃下固定6~18小時。過碘酸可氧化細胞的糖鏈產生醛基,再與賴氨酸的氨基結合使糖類得以固定,多聚甲醛可以固定蛋白質和類脂質。由於組織抗原絕大多數是由糖和蛋白質所構成,所以其能較好地保存組織的抗原性。
3.切片 將固定後的組織浸入20%~30%的蔗糖-PBS液(為防止速凍時產生冰晶),在4℃下過夜,而後速凍。用恒冷冷凍切片機切成20μm的厚片。有條件的最好采用振動切片機製作厚片,此時不用速凍。將切好的組織厚片置於10%蔗糖-PBS液中在4℃下過夜備用。
4.標記 免疫電鏡的標記方法和光鏡免疫組化染色方法基本相同,可以采用直接法、間接法、PAP法、ABC法以及SPA法等。但目前多采用直接法或間接法,因為PAP法等雖然敏感性高,但其複合物分子較大,穿透組織能力較弱,結果常不理想。
酶標法的優點為:①酶標抗體相對分子質量小,穿透組織能力強,敏感性高,適用於包埋前法;②其方法與免疫酶組織化學方法相同,能很好地進行光鏡與電鏡的對比觀察;③酶標抗體的穩定性好,可應用SPA法、PAP法或ABC法以提高其敏感性。其不足之處為:①反應最終產物鋨黑的電子密度較金屬標記物低,不宜用醋酸鈾和枸櫞酸鉛作對比染色,因此組織的超微結構不夠清楚;②用於抑製內源性辣根過氧化物酶活性的H2O2會破壞抗原和細胞的超微結構。
二、操作方法
(一)包埋前法 即先做免疫組化染色,再按常規電鏡檢查要求進行脫水、包埋、超薄切片和電鏡觀察。其優點為:①由於先做免疫組化染色,組織內抗原破壞較少,易獲成功;②適用於冷凍切片、振動切片機切出的厚片、生長在蓋玻片上的培養細胞以及細胞懸液和塗片;③可進行光鏡和電鏡的對比定位觀察;④可根據免疫組化染色結果選材後再做免疫電鏡觀察,陽性檢出率高。其缺點主要為免疫試劑不易穿透厚組織片,因此其一般采用酶標記法,並需采取一些增強抗體穿透性的措施。
1.取材 其與普通電鏡取材方法相同。
2.前固定 其目的是既要保存好細胞的超微結構,又要盡可能保持待測抗原結構不受破壞,但要兩者兼顧常十分困難。目前較為常用的固定劑有:
(1)多聚甲醛-戊二醛固定液(paraformaldehyde-glutaldehyde,PG):多聚甲醛的濃度一般為1%~4%,戊二醛的濃度一般為0.01%~0.5%。一般需在4℃下固定2~10小時。
(2)過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液(periodate-lysine-paraformaldehyde,PLP):一般需在4℃下固定6~18小時。過碘酸可氧化細胞的糖鏈產生醛基,再與賴氨酸的氨基結合使糖類得以固定,多聚甲醛可以固定蛋白質和類脂質。由於組織抗原絕大多數是由糖和蛋白質所構成,所以其能較好地保存組織的抗原性。
3.切片 將固定後的組織浸入20%~30%的蔗糖-PBS液(為防止速凍時產生冰晶),在4℃下過夜,而後速凍。用恒冷冷凍切片機切成20μm的厚片。有條件的最好采用振動切片機製作厚片,此時不用速凍。將切好的組織厚片置於10%蔗糖-PBS液中在4℃下過夜備用。