第一節基本原理
許多物質的溶液是有顏色的，不同物質由於其分子結構不同，對不同波長光線有不同吸收能力，故每種物質都具有其特異的吸收光譜。有色溶液顯現的顏色實質上是它所選擇吸收光的互補色，例如溶液呈黑色，是對可見光區的各色光幾乎都吸收；溶液為無色，是對可見光幾乎無吸收作用。無色溶液所含物質可以吸收特定波長的紫外線或紅外線。在一定條件下，溶液對光的吸收程度與該物質濃度成正比，因此可利用各種物質的不同的吸收光譜特征對不同物質進行定性和定量分析。一般把用物質特有的吸收光譜來鑒定物質性質及含量的技術，稱為分光光度法，其理論依據是Lambert-Beer定律。
分光光度法是比色法的發展，比色法隻限於在可見光區，分光光度法則可以擴展到紫外光區和紅外光區，比色法用的單色光，是來自濾光片，譜帶寬度從40～120nm，精度不高；分光光度法則要求近於真正單色光，來自棱鏡或光柵，具有較高的精度，其光譜帶寬最大不超過3～5nm，在紫外區可達到1nm以下。
一、光的基本知識
光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續的微粒性和連續的波動性。波長和頻率是光的波動性的特征，可用下式表示：
λ=c／γ
式中λ——波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長；
γ——頻率，即每秒鍾振動次數；
c——光速，等於299770km／s。
光屬於電磁波，自然界中存在各種不同波長的電磁波。
分光光度法所使用的光譜範圍在200nm～10μm（1μm=1000nm）。其中200～400nm為紫外光區，400～760nm為可見光區，760～10000nm為紅外光區。可見光區的電磁波，因波長不同而呈現不同顏色，這些不同顏色的電磁波稱為單色光，單色光並非單一波長的光，而是一定波長範圍內的光。太陽及鎢絲燈發出的白光，是各種單色光的混合光。利用棱鏡可將白光分成各種單色光，即紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等，這就是光譜。
二、吸光度與透光率
當一束平行單色光照射到任何均勻、透明的溶液上時，光的一部分被吸收，一部分被容器的表麵反射，一部分透過溶液。如果入射光強度為I0，吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，T是透光率，為透過光強度與入射光強度之比，則T=It／I0。吸光度A=lg（1／T）=-lgT，A是透光率倒數的對數，即透光率的負對數，隻有吸光度才與濃度呈正比。
三、朗伯——比爾（Lambert-Beer）定律
朗伯——比爾定律是利用分光光度計進行比色分析的基本原理，此定律是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。
1.朗伯定律
一束單色光通過溶液後，由於溶液吸收了一部分光能，光的強度就要減弱，若溶液濃度不變，則溶液的厚度（L）愈大（即光在溶液中所經過的途徑愈長），光的強度減低也愈顯著。即吸光度與溶液液層的厚度成正比。
A=K1L
式中K1——吸光係數，其值取決於入射光的波長、溶液性質、溶液濃度及溫度等；
L——溶液的厚度。
2.比爾定律
當一束單色光通過有色溶液時，若溶液的厚度不變而濃度不同時，則溶液濃度愈大光線強度的減弱也愈顯著，即吸光度與溶液的濃度成正比。與Lambert定律推導相似，兩者的關係可表示如下：
A=k2c
式中k2——吸光係數，其值取決於入射光的波長、溶液性質、溶液濃度及溫度等；
c——有色溶液的濃度。
3.Lambert-Beer定律及應用
如果同時考慮溶液的濃度c和液層的厚度L對光吸收的影響，則必須將朗伯定律和比爾定律合並起來得：
A=KLc
此式表明吸光度與溶液的濃度和液層的厚度乘積成正比，這就是朗伯——比爾定律。
朗伯——比爾定律不僅適用於可見光區，也適用於紫外及紅外光區；不僅適用於溶液，也適用於其它均勻的、非散射的吸光物質，是各類分光光度法的定量依據。
第二節分光光度計的基本結構
能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來，並測量其強度的儀器稱為分光光度計。
一、一般構造
分光光度計因使用的波長範圍不同而分為紫外光區、可見光區、紅外光區以及萬用（全波段）分光光度計等。無論哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、比色杯及檢測器係統。
一個良好的光源要求具備發光強度高，光亮穩定，光譜範圍較寬和使用壽命長等特點。分光光度計上常用的光源有兩種，即鎢燈和氫燈。一般的分光光度計采用穩控的鎢燈，適用於340～900nm範圍的光源，更先進的分光光度計中有穩壓調控的氫燈，適宜於作200～360nm的紫外光分析光源。
2.單色器
單色器是將混合光波分解為單一波長的裝置。多用棱鏡或光柵作為色散元件，光波通過棱鏡時，不同波長的光折射率不同。波長越短，傳播速度越快，折射率越大；反之，波長越長，傳播速度越慢，折射率越小，因而能把不同波長的光分開。
3.狹縫
狹縫是由一對隔板在光通路上形成的縫隙，通過調節縫隙的大小來調節入射單色光的強度，並使入射光形成平行光線，以適應檢測器的需要。
4.比色杯
比色杯又稱作吸收杯、樣品杯，是光度測量係統中最重要的部件之一，一般由玻璃或石英製成。不同的檢測波長選擇不同材質的比色杯，在可見光區或近紅外光區檢測應選用光學玻璃比色杯，在紫外光區檢測應選用石英比色杯。
為保證吸光值測量的準確性，保護比色杯的質量是取得良好的分析結果的重要條件之一，因此不得用粗糙堅硬物質接觸比色杯；不能用手指拿取比色杯的光學麵；用後要及時洗滌比色杯，不得殘留測定液。
5.檢測器係統
有許多金屬能在光的照射下產生電流，光愈強電流愈大，此即光電效應。因光照射而產生的電流稱作光電流。受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產生的電流較大，可直接用微電流計量出。但是，當連續照射一段時間會產生疲勞現象而使光電流下降，要在暗中放置一些時候才能恢複。因此使用時不宜長期照射，隨用隨關，以防止光電池因疲勞而產生誤差。光電管裝有一個陰極和一個陽極，陰極是用對光敏感的金屬（多為堿土金屬的氧化物）做成，當光射到陰極且達到一定能量時，金屬原子中電子發射出來。光愈強，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負電的，被吸引到陽極上而產生電流。光電管產生電流很小，需要放大。分光光度計中常用電子倍增光電管，在光照射下所產生的電流比其它光電管要大得多，這就提高了測定的靈敏度。
檢測器產生的光電流以某種方式轉變成模擬的或數字的結果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計算機聯用等，數字輸出則通過模擬數字轉換裝置如數字式電壓表等進行。
二、一般操作程序
1.分光光度計的一般操作程序
（1）選定合適的波長作為入射光，接通電源預熱儀器。
（2）調透光率為零，即儀器零點。
（3）將參比溶液置於光路，接通光路（蓋上吸收池暗箱蓋），調T％=100.0，（2）、（3）步應反複調整，達到A=0。
（4）將樣品溶液推入光路，讀取吸光度A。
（5）測定完成後，應整理好儀器，尤其要注意吸收池應及時清洗幹淨。
對於不同型號的分光光度計其具體的操作步驟不完全相同，可參見各儀器說明書。
2.使用注意事項
（1）分光光度計屬精密儀器，應精心愛護使用，防震、防潮、防腐蝕。
（2）要保持比色杯的清潔幹淨，保護光學麵的透明度。
（3）讀取光密度值的時間應盡量縮短，以防光電係統疲勞，如連續使用時，中間應適當使之避光休息。
（4）比色杯不要放置在儀器麵上，以免液體腐蝕儀器表麵。
（5）調0位及100％旋鈕要輕旋，旋到終點時指針仍未指到位，一定不能再用力旋，以免損壞電位器。
第三節分光光度技術的基本應用
一、測定溶液中物質的含量
可見或紫外分光光度法都可用於測定溶液中物質的含量，方法有以下幾種。
1.直接比較法（標準管法）
測定標準溶液（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測定的溶液）的吸光度，進行比較，由於所用比色杯的厚度是一樣的，溶液的濃度和吸光度值成正比關係，由此得出未知樣品溶液的濃度。
2.標準曲線法
先測出已知的不同濃度（c）的標準液的吸光度（A），以A為縱坐標，濃度c為橫坐標，繪製標準曲線，在選定的濃度範圍內標準曲線應該是一條直線，然後測定出未知液的吸光度，即可從標準曲線上查到其相對應的濃度。
含量測定時所用波長通常要選擇被測物質的最大吸收波長，這樣做有兩個好處：
（1）靈敏度大，物質在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；
（2）可以避免其它物質的幹擾。
二、用吸收光譜鑒定化合物
使用分光光度計可以繪製吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然後以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪製吸光度——波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。
各種物質有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質的定性鑒定。一定物質在不同濃度時，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長是一定不變的。因此，當一種未知物質的吸收光譜曲線和某一已知物質的吸收光譜曲線形狀一樣時，則很可能它們是同一種物質。
紫外線吸收是由不飽和的結構造成的，含有雙鍵的化合物表現出吸收峰。紫外吸收光譜比較簡單，同一種物質的紫外吸收光譜應完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結構不一定相同。除了特殊情況外，單獨依靠紫外吸收光譜決定一個未知物結構，必須與其它方法配合。紫外吸收光譜分析主要用於已知物質的定量分析和純度分析。
第四節提高測量精確度的方法
測量的精確度是指測量數據集中於真實值附近的程度。測量的精確度高，說明測量的平均值接近真實值，且各次測量的數據又比較集中，即測量的係統誤差和偶然誤差都比較小，測量既準確又精密。要提高測量的精確度從以下幾個方麵進行考慮。
一、入射光波長的選擇
波長對測量結果的影響程度與波長測定點在被測物品光譜曲線的位置及儀器波長誤差的大小有關，當波長測量點位於被測樣品尖銳的吸收峰上或於較陡的斜坡上時，波長的較小偏移將會引起光度測量值的較大的變動。為使測定結果有較高的準確度，在一般情況下，入射光應選擇被測物質溶液的最大吸收波長。
二、分析方法的誤差
在分光光度法中，即使將各種因素都控製好，對於濃度過大或過小的樣品，誤差仍然很大。因為濃度過大的樣品，其吸光度過高，影響檢測器的靈敏度，且讀數標尺刻度的精度差，誤差亦大。濃度過低的樣品，其吸光度小，因與儀器本身因素有關，也容易引起檢測器標尺上的讀數誤差。例如光源波動的影響：當光源強度改變1％、吸光度為1.0時，隻有0.4％的誤差，但在吸光度為0.045時，則可產生9.6％的誤差。實際上，在整個透光度（或吸光度）範圍的不同部分均有不同的誤差。從理論上推算，相對誤差最小的部分在透光度為36.8％處（或吸光度為0.4343處），故通常認為測定值在吸光度0.20～0.80範圍內（透光度為20％～65％）誤差較小，超出此範圍，相對誤差均會增大。
影響分光光度法精確度的主要原因還有光譜純度。分光光度計應能正確選出光源光譜中所需部分波長作為入射光，一般應保持光譜帶寬度在10nm以下，如果測定樣品有很狹窄的吸收峰，就必須有更小的光譜寬度，所以分光光度計大多均有可調的狹縫。
散射光也是引起誤差的重要因素。這裏所說的散射光是指一切未經過測定溶液吸收，而又落到檢測器上引起幹擾的光，如室內自然光，經過某些漏洞進入儀器而明顯增大了透光度，故高靈敏度的分光光度計宜安裝在光線較暗的室內。散射光也包括能透過比色皿的非測定需要的其他波長的光，實際上是光譜不純，但因效果與散射光一樣，故也稱為散射光幹擾。散射光幹擾對高濃度測定特別有害，能使吸光度降低，標準曲線的高濃度部分向下彎曲。
層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903—1906年由俄國植物學家MTsweet首先係統提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，並繼續以石油醚淋洗，由於CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現了不同顏色的譜帶或稱色譜圖（Chromatogram）。當時這種方法並沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應用到分離複雜的有機混合物，人們才發現了它的廣泛用途。
隨著科學技術的發展以及生產實踐的需要，層析技術也得到了迅速的發展。層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質；而且它既可以用於少量物質的分析鑒定，又可用於大量物質的分離純化製備。因此，作為一種重要的分析、分離手段與方法，它廣泛地應用於科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫藥衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。
第一節層析的基本理論
層析法是一種基於被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方麵的差異，使其在流動相與固定相之間的分配係數（或稱分配常數）不同，達到彼此分離的目的。
一、層析的基本概念
1.固定相
固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質（如吸附劑、凝膠、離子交換劑等），也可以是液體物質（如固定在矽膠或纖維素上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附、溶解、交換等作用。固定相對層析的效果起著關鍵的作用。
2.流動相
在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。
3.分配係數及遷移率（或比移值）
分配係數是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用K來表示。分配係數是層析中分離純化物質的主要依據。
K=cs／cm
式中cs——固定相中的濃度；
cm——流動相中的濃度。
遷移率（或比移值）是指：在一定條件下，在相同的時間內某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值，常用Rf來表示。
實驗中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內，某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質在固定相中移動的距離之比值。它可以小於等於1，也可以大於1，用Rx來表示。不同物質的分配係數或遷移率是不同的。分配係數或遷移率的差異程度是決定幾種物質采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。
總之，影響分離度或者說分離效率的因素是多方麵的。我們應當根據實際情況綜合考慮，特別是對於生物大分子，我們還必須考慮它的穩定性、活性等問題。如pH、溫度等都會產生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的，否則，我們將不能得到預期的效果。
二、層析法的分類
層析根據不同的標準可以分為多種類型：
1.根據固定相基質的形式分類
根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。
（1）紙層析（paper chromatography）是指以濾紙作為基質的層析。以濾紙作為液體的載體，點樣後，用流動相展開，以達到組分分離目的。
（2）薄層層析（thin layer chromatography）以一定顆粒度的不溶性物質，均勻塗鋪在薄板上。點樣後，用流動相展開，使組分達到分離的目的。
（3）柱層析（column chromatography）是指將固定相裝柱後，用洗脫液洗脫使樣品沿一個方向移動，以達到分離目的。
紙層析和薄層層析主要適用於小分子物質的快速檢測分析和少量分離製備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用於樣品分析、分離。生物化學中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。
2.根據流動相的形式分類
根據流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化，大大限製了其在生化領域的應用，主要用於氨基酸、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領域最常用的層析形式，適於生物樣品的分析、分離。
3.根據分離的原理不同分類
根據分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。
（1）吸附層析（adsorption chromatography）是以吸附劑為固定相，根據待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術。
（2）分配層析（partition chromatography）是根據在一個有兩相同時存在的溶劑係統中，不同物質的分配係數不同而達到分離目的的一種層析技術。
（3）凝膠過濾層析（gel chromatography）是以具有網狀結構的凝膠顆粒作為固定相，根據物質的分子大小不同進行分離的一種層析技術。
（4）離子交換層析（ion exchanger chromatography）是以離子交換劑為固定相，根據物質的帶電性質不同進行分離的一種層析技術。
（5）親和層析（affinity chromatography）是根據生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑製劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結合的生物大分子進行分離的一種層析技術。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術，具有很高的分辨率。
第二節常用的層析技術介紹
一、吸附層析
吸附層析是以吸附劑為固定相，根據待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術。
1.吸附層析原理
吸附作用是指某些物質（稱吸附劑）能夠從溶液中將溶質濃集在其表麵的現象。吸附劑吸附能力的強弱，除決定於吸附劑和被吸附物質本身的性質外，還和周圍溶液的組成有密切關係。當改變吸附劑周圍溶液的成分時，吸附劑的吸附能力即可發生變化，往往可使能吸附物質從吸附劑上解吸下來，這種解吸過程稱為洗脫或展層。因此，當樣品中的物質被吸附劑吸附後，用適當的洗脫液衝洗，就能改變吸附劑的吸附能力，將被吸附的物質解吸下來，隨著洗脫液向前移動，該物質又遇到前麵新的吸附劑而再次被吸附，在後來的洗脫液的衝洗下又重新解吸下來，繼續向前移動。經過這樣反複的吸附→解吸→再吸附→再解吸的過程。物質就可以不斷向前移動。由於吸附劑對樣品中各組分的吸附能力不同，它們在洗脫劑的衝洗下移動的速度也就不同，因而能逐漸分離開來。
2.吸附劑的選擇
吸附劑的選擇是否合適是吸附層析的關鍵。常用的吸附劑有矽膠、氧化鋁、矽藻土、纖維素等。矽膠為微酸性吸附劑，適合分離酸性和中性物質；氧化鋁是微堿性吸附劑，適合分離堿性和中性物質；矽藻土、纖維素為中性吸附劑，適合分離中性物質。吸附劑的顆粒應有一定細度，並且粒度要均勻。一般顆粒直徑為無機類0.07～0.1mm（150～200目）；有機類0.1～0.2mm（70～140目）。顆粒太粗，層析時溶劑推進快，但分離效果差，而顆粒太細，展開太慢，易產生斑點不集中，並有拖尾現象。
3.吸附能力
吸附能力一般用活度來表示，吸附劑吸附能力主要受吸附劑含水量的影響，其由強到弱的程度以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ來表示。吸附劑活度強時能吸附極性較小的基團；吸附劑活度弱時對非極性基團吸附能力也較強。一般利用加熱烘幹的方法，減少吸附劑的水分，從而增加其活度。通常，分離水溶性物質時，因其本身具有較強極性，吸附劑活度要弱一些；相反，分離脂溶性物質時，吸附劑活度要強一些。
4.吸附劑的裝填方式
吸附層析根據吸附劑的裝填方式可分為柱層析法和薄層層析法兩種。
（1）柱層析法柱層析需選擇一根適當尺寸的層析管，裝一定量的吸附劑，然後加入樣品溶液，待樣品全部流入吸附劑內後，再加入洗脫液進行洗脫，不同組分即以不同的速度向下流動而逐漸分離開來。分步收集洗脫液，即可得到各組分的溶液，供進一步處理和測定。
（2）薄層層析法薄層層析法是把吸附劑均勻地塗在玻璃板上，鋪成薄層。把要分離的樣品加在薄層的一端，在密閉的容器中用適當的溶劑展層後達到分離鑒定的目的。
薄層層析的優點是：設備簡單、操作容易、層析時間短、分離效率高，是發展較快的一種微量快速的層析方法，可用於氨基酸、核苷酸、糖類、脂類和激素等物質的分離和鑒定。