5.限製性核酸內切酶的緩衝液
限製性核酸內切酶的標準緩衝液的組分包括氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、Tris·HCl、β巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發揮，需要2價陽離子，通常是Mg2＋。不正確的NaCl 或Mg2＋濃度，不僅會降低限製酶的活性，而且還可能導致識別序列特異性的改變。緩衝液Tris·HCl 的作用在於，使反應混合物的pH值恒定在酶活性所要求的最佳數值範圍內。對絕大多數限製酶來說，在pH＝ 7.4的條件下，其功能最佳。
巰基試劑對於保護某些限製性核酸內切酶的穩定性是有用的，而且還可使其免於失活。在“非最適的”反應條件下（包括高濃度的限製性核酸內切酶、高濃度的甘油、低離子強度、用Mn2＋取代Mg2＋以及高pH值等等），有些限製性核酸內切酶識別序列的特異性會發生改變，導致從識別序列以外的其他位點切割DNA分子。有的限製性核酸內切酶在緩衝液成分的影響下會產生所謂的“星號”活性。
2.2DNA連接酶
2.2.1連接機理
1967年，世界上有數個實驗室幾乎同時發現了一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶（DNAligase）。DNA連接酶廣泛存在於各種生物體內。在大腸杆菌及其他細菌中，DNA連接酶催化的連接反應是利用NAD＋（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能源；在動物細胞及噬菌體中，DNA連接酶則是利用ATP（腺苷三磷酸）作為能源。其催化的基本反應是將一條DNA鏈上的3′末端遊離羥基與另一條DNA鏈上的5′末端磷酸基團共價結合形成3′，5′磷酸二酯鍵，使兩個斷裂的DNA片段連接起來，因此它在DNA複製、修複以及體內體外重組過程中起著重要作用。
DNA連接酶催化的連接反應分為三步：①由ATP（或NAD＋）提供AMP，形成酶AMP複合物，同時釋放出焦磷酸基團（PPi）或煙酰胺單核苷酸（NMN）；②激活的AMP 結合在DNA鏈5′端的磷酸基團上，產生含高能磷酸鍵的焦磷酸酯鍵；③與相鄰DNA鏈3′端羥基相連，形成磷酸二酯鍵，並釋放出AMP。
值得注意的是，DNA連接酶所連接的是切口（nick），無法連接裂口。另外，DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。
2.2.2DNA連接酶的種類
已發現的DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶（又稱T4DNA連接酶）和大腸杆菌DNA連接酶。
T4噬菌體DNA連接酶（又稱T4DNA連接酶）的相對分子質量為68000，最早是從T4噬菌體感染的大腸杆菌中提取的。T4噬菌體DNA連接酶可以連接：①兩個帶有互補黏性末端的雙鏈DNA分子；②兩個帶有平頭末端的雙鏈DNA分子；③一條鏈帶有切口的雙鏈DNA分子；④RNA：DNA雜合體中RNA鏈上的切口，也可將RNA末端與DNA鏈連接。
由於T4噬菌體DNA連接酶可連接的底物範圍廣，尤其是能有效地連接DNA分子的平頭末端，因此在DNA體外重組技術中廣泛應用。
雖然兩個完全斷開的平頭末端DNA分子在T4噬菌體DNA連接酶作用下可以連接，但是連接速度非常緩慢，因此需要回收大量的酶切片段。在平頭末端連接反應中，若加入適量的一價陽離子和低濃度的PEG，可提高T4噬菌體DNA連接酶對平頭末端的連接活性。