第13章 基因工程基本操作技術(3)(1 / 3)

RNA酶抑製劑主要有:①RNA酶的蛋白質抑製劑。目前從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合形成非共價結合的等摩爾複合物,可使RNA酶失活。此蛋白質在體內可能是血管生成素的抑製劑,血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子。由於酚抽提可以去除蛋白質抑製劑,故應在純化過程中補加幾次抑製劑。②氧釩核糖核苷複合物。這種由氧釩( Ⅳ)離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的複合物,是一種過渡態類似物,它能與多種RNA酶結合並幾乎能百分之百地抑製RNA酶的活性。這4種氧釩核糖核苷複合物可加入完整細胞中,在RNA提取和純化的所有過程中,其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在蛙卵母細胞中進行翻譯,並能作為某些體外酶促反應(如mRNA反轉錄)的模板。然而氧釩核糖核苷複合物強烈抑製mRNA在無細胞體係中的翻譯,因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以去除之。

細胞內總RNA的抽提方法很多,在實難室中常采用的方法有兩種,一種是酚異硫氰酸胍抽提法和矽膠膜純化法。

1.酚異硫氰酸胍抽提法

TRIZOL 試劑是使用最廣泛的抽提總RNA的專用試劑,由Gibco 公司根據酚異硫氰酸胍抽提法設計,主要由苯酚和異硫氰酸胍組成,適用於絕大多數生物材料。對任何生物材料的RNA的提取,首先研磨組織或細胞,或使之裂解;加入TRIZOL 試劑,進一步破碎細胞並溶解細胞成分,還可保持RNA的完整;加入氯仿抽提,離心,水相和有機相分離;收集含RNA的水相;通過異丙醇沉澱,可獲得RNA樣品。該RNA樣品幾乎不含蛋白質和DNA,可直接用於Northern 雜交、斑點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNase 保護分析(RNase protection assay)和分子克隆。

2.矽膠膜純化法

RNeasy 試劑盒由Qiagen 公司設計,其設計思路與DNA的分離純化思路相似,也就是含有目的RNA的細胞破碎液通過矽膠膜時,RNA吸附在矽膠膜上,從而與其他細胞成分分開,然後在低鹽濃度下RNA可從矽膠膜上洗脫出來。其技術將異硫氰酸胍裂解的嚴格性和矽膠膜純化的速度和純度相結合,簡化了總RNA的分離程序。相當於將異硫氰酸胍裂解法製備的RNA的水相,通過矽膠膜來純化。用該試劑盒分離純化的RNA純度高,含有極少量的共純化DNA。

上述兩種方法純化的RNA如果要用於對少量DNA也敏感的某些操作,如PCR操作,可使用無RNA酶的DNase Ⅰ(RNase Free DNase Ⅰ)處理去除痕量的DNA。如果需要特別純淨的樣品,可以通過CsCl 密度梯度離心來純化。

分離的總RNA可利用mRNA3′末端含有poly(A)+的特點,當總RNA流經oligo(dT)纖維柱時,在高濃度鹽緩衝液作用下,mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上,然後逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。

核酸提取注意事項如下:

(1)在核酸提取時,為了增加細胞的裂解度,增加核蛋白複合體破碎度,以釋放更多的遊離核酸,常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在確保沒有核酸水解酶存在的前提下,酶反應時間越長越好。

(2)有時在使用蛋白酶時,為了抑製核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶緩衝液中用終濃度為5mmol/L 的EDTA 代替NaCl,並且可將反應溫度提高到50~60℃,並將反應時間縮短到15~25min,但酶用量必須提高10~20倍。溶菌酶使用時緩衝液中需加EDTA,因遊離金屬離子對酶有抑製。

(3)許多植物材料中富含酚,在細胞破碎時,在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的醌類物質,影響核酸的提取及降低提取質量,在提取液中加入PVP 和巰基乙醇對降低酚類的幹擾可能有所幫助。PVP將與酚形成複雜的聚合體,在提取時將酚從核酸成分中遊離,且PVP 與巰基乙醇作為強還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑製核酸水解酶的作用。