選擇要使用的啟動子，從而決定要轉錄哪一條鏈。在轉錄區下遊選擇一個酶切位點，用限製性內切酶將載體線性化以防止轉錄出載體的序列和多聯體產物。加入對應的噬菌體RNA聚合酶、NTP和某個標記的NTP在體外進行轉錄，合成出標記的單鏈RNA。利用無RNA酶活性的DNA酶處理以及後續純化步驟可獲得純化的單鏈RNA探針。單鏈RNA探針的製備不僅比單鏈DNA探針更容易，而且其產生的雜交信號更強。
2.末端標記
直接將探針分子的某個原子替換為放射性同位素原子，或直接在探針分子上加入標記的原子或複合物，這種直接標記一般是在探針分子的末端進行，亦稱末端標記。經末端標記的核酸分子除了用作分子雜交的探針外，更多地用於RNA的S1核酸酶作圖，以及用作引物延伸反應中的標記引物和凝膠電泳中的相對分子質量標準。
（1）DNA片段的末端標記 末端標記主要通過酶促反應來完成，但標記的方式很多。如Klenow DNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在對DNA片段進行末端補平反應或平末端的置換反應時可引入標記的核苷酸，T4多核苷酸激酶可以在DNA的5′末端引入標記的磷酸基團或將5′末端的磷酸基團用標記的磷酸基團置換，末端轉移酶可以使DNA的3′末端連接標記的核苷酸。
（2）寡核苷酸的標記 合成的寡核苷酸主要通過T4多核苷酸激酶在5′末端引入標記的磷酸基團進行標記，也可利用末端轉移酶在3′末端連接標記的核苷酸。如果想提高標記物的比活度，也可利用Klenow DNA聚合酶做引物延伸反應，用合成的更短的寡核苷酸作引物或合成兩個部分互補的寡核苷酸使之互為引物互為模板，在DNA合成過程中引入標記的核苷酸。
在分子克隆操作中用於標記核酸分子的標記物主要是放射性同位素，如32P、33P 和35S。32P的半衰期較短，為14.3d，其放射性粒子的穿透力較強；33P 的半衰期較長，為25.4d，穿透力較弱，產生信號不如32P 強。在摻入核苷酸的標記過程中，隻有三磷酸核苷的α位磷酸整合到核酸鏈中，因此使用α位磷酸被標記的三磷酸核苷，如［α32P］dATP。而在標記5′末端磷酸基團的反應中使用γ 位磷酸被標記的ATP。放射性的信號通過X 光片放射自顯影或磷屏掃描獲取。
非放射性標記物應用最成功的是Roche 公司（原德國寶靈曼公司）開發的地高辛（digoxygenin，DIG）標記核酸探針。將DIG 與dUTP 交聯，在摻入核苷酸的標記反應中用DIG 11dUTP（或DIG 11UTP）取代dTTP（TTP），使探針DNA或RNA分子被DIG 標記。DIG標記的檢測是該技術的核心，即利用抗DIG的抗體通過酶聯免疫反應來完成。將抗DIG 的抗體與堿性磷酸酶偶聯，通過免疫反應將堿性磷酸酶攜帶到目的核酸分子處，在加入顯色劑BCIP/NBT（5溴4氯3吲哚磷酸鹽/鹽酸氮藍四唑）後堿性磷酸酶與顯色劑反應形成濃紫色偏棕色沉澱，從而顯示出目的分子的有無和位置。除了地高辛和堿性磷酸酶外，還有其他的標記配基和偶合酶，如生物素和辣根過氧化物酶等。另外，這些偶合酶也可催化某些化合物的化學發光反應，通過X 光片或磷屏掃描獲取發光信號。
非放射性核酸探針的標記方法主要包括酶促標記法和化學標記法。生物素和地高辛標記的dNTP 可以與放射性核素標記的dNTP 一樣，用多種酶促方法（例如缺口平移法、隨機引物法及末端轉移酶末端標記法等）進行探針（包括DNA、RNA及寡核苷酸探針）的標記。由於生物素等標記物是連接在堿基上而不是在磷酸基團上，因此不能用多核苷酸激酶法進行末端標記。化學標記法是利用標記物分子上的活性基團與待標記的核酸分子上的基團發生化學反應，從而將標記物直接結合到核酸分子上。
非放射性標記在使用過程中不僅安全，而且使用方便、標記的探針可保存並可重複使用、便於控製顯色反應、顯色後的雜交膜可長期保存、雜交信號的灰度明顯（特別是在菌落雜交中易於辨別真假陽性）。但其檢測靈敏度不夠高，而且雜交膜不易二次或多次雜交。
在Western 雜交中，一般不直接標記針對目的蛋白的特異性抗體，而是采用二次免疫的方式標記二級抗體，即標記抗特異性抗體的抗體。早期的研究工作中一般采用125I 標記抗體，但由於125I 的半衰期很長（60d），危險性很大，現在已被非放射性標記取代。其標記方式與核酸的非放射性標記類似，主要用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶與抗抗體偶聯，再與顯色劑BCIP/NBT 或二氨基聯苯胺（DAB）反應形成有色沉澱，或催化發光反應。