若在操作中采用熱啟動方式或在PCR擴增程序設計上運用退火溫度降落方式（touch downPCR），可以減少引物二聚體的生成。另一方麵，PCR擴增退火溫度常根據較低的Tm 值選定，故3′端引物與5′端引物應有相接近的Tm 值，其差別不應大於5℃，否則難以保證擴增的效果。
（5）引物末端修飾。在PCR擴增中，引物的3′端是引發延伸的起點，因此一定要與模板準確配對，不能進行任何修飾。引物的5′端並無嚴格的限製，在與模板結合的引物長度足夠的前提下，其5′端堿基可不與模板DNA互補而成遊離狀態。通常這些遊離序列對引物與模板的結合並無顯著影響，因此引物的5′端可以被修飾，如引入突變位點，用生物素、熒光素、地高辛等化學物質標記，引入蛋白質結合DNA序列，添加限製性酶酶切位點序列便於擴增產物的下一步克隆等。
2.引物3′端的末位堿基
引物3′端的末位堿基對TaqDNA聚合酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配概率明顯高於其他3個堿基，因此應當避免在引物的3′端使用堿基A。當末位堿基為T 時，在錯配的情況下也能引發鏈的合成，所以也應盡量避免在引物的3′端第一位堿基使用T。引物3′端末位堿基最佳選擇是G和C，因為它們形成的堿基配對比較穩定。
3.引物設計軟件
引物的設計要考慮多方麵的因素，設計出的引物在PCR擴增中具有重要的地位，直接關係到靶DNA片斷能否擴出，擴出的效率有多高，是否存在非特異擴增現象等，因此要進行科學的設計。引物的設計通常通過有關設計軟件得以完成。目前常用的專門設計軟件主要包括“Oligo”和“Primer Premier”，它們均具有引物的自動搜索功能和引物分析評價功能，但兩者側重點不同，“Primer Premier”自動搜索功能最強且方便使用。除了上述兩種設計軟件外，“Dnassist”、“Omiga”和“DNAstar”都可以用於引物設計。隨著國際互聯網的普及與發展，很多大型生物技術公司提供的網絡在線引物設計平台，如Invitrogen公司、Roche公司等網站均提供在線引物設計。
5.2聚合酶鏈反應技術類型
PCR技術從1985年建立以來，在過去的20多年裏發展極快，從早期的簡單擴增發展為一係列的技術體係，不僅可以擴增兩段已知序列間的DNA，現在發展到可以擴增已知序列兩側的未知序列，甚至可以擴增序列未知的新基因，衍生出的方法達到幾十種，並且還在不斷發展、完善，功能上不僅可以用於DNA的單純擴增，還可以用於DNA的定點突變，基因的定量和基因的連接等。
5.2.1已知DNA序列的聚合酶鏈反應擴增
對已知DNA序列的體外酶促擴增，是PCR的最初功能。作為PCR的靶DNA一般是一個待擴增的特定雙鏈DNA片斷，應知道其全序列或其兩端20～30bp 的核苷酸序列以供設計3′端、5′端引物之用。靶DNA可以是環狀DNA分子的一部分，也可以是線型DNA分子的一部分。按照PCR的原理與操作要求，在冰上分別把人工合成的一對特異引物、提取或分離的靶DNA、dNTP、Mg2＋、PCR反應緩衝液、耐熱DNA聚合酶等按一定的濃度或量要求添加到反應管中，混合後置於PCR儀中，設定變性、退火、延伸三步反應的溫度與時間及循環次數，編好反應程序並運行。但在有些情況下，若引物的退火溫度與DNA聚合酶的酶催化活性溫度相近，則可以把退火與延伸兩步過程合二為一，隻需使延伸時間稍微延長即可，使PCR擴增程序更為簡單。擴增結束後取適量產物通過凝膠電泳即可鑒定擴增的效果。對於此類已知DNA序列的PCR擴增，經常用於重組子的鑒定、微生物類型鑒定、親子鑒定等方麵。
5.2.2逆轉錄聚合酶鏈反應
PCR技術不僅可以用於DNA靶序列的擴增，也可以用於RNA靶序列的擴增。RNA水平的PCR通常稱為逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse tranion‐polymerase chain reaction，RT‐PCR），有時也稱為反轉錄PCR、RNAPCR，它是一種將mRNA反轉錄與PCR技術相偶聯的靶基因分離技術。通過mRNA反轉錄得到對應的cDNA，然後利用特定的PCR引物直接以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得大量的靶DNA序列。反轉錄可以用總RNA或分離出的總poly（A）RNA為模板進行，反轉錄產物無需轉變成雙鏈cDNA即可進行PCR擴增。RT‐PCR為經cDNA分離特定表達基因提供一種通用、便捷的手段。