在DNA重組實驗中,外源目標DNA片段與載體DNA雖然經重組連接,但並不是都能夠正確連接,形成了理想的重組子,而是形成了混合的連接反應物,在轉化前一般並不對其進行分離就直接用於轉化。因此,這時用於轉化的DNA反應物實際上是由多種類型的DNA分子組成的混合物,其中包括:①不帶任何外源DNA插入片段,僅是由線性載體分子自身連接形成的環狀DNA分子,即空載體;②由一個載體分子和一個或數個外源DNA片段構成的重組體DNA分子;③單純由數個外源DNA片段彼此連接形成的多聚DNA分子。另外,在轉化實驗中,也並不是所有的重組子都能通過轉化形成轉化子。因此,由這種連接混合物轉化而來的成千上萬個宿主細胞群中,真正含有期望的重組DNA分子的比例很少。所以,必須使用各種篩選與鑒定手段區分轉化子(接納載體或重組分子的轉化細胞)與非轉化子(未接納載體或重組分子的非轉化細胞)。而轉化子又分為含有重組分子的轉化子和僅含空載載體分子(非重組子)的轉化子。前者所含的重組DNA分子中有期望重組子(含有目的DNA的重組子)與非期望重組子(不含目的DNA的重組子)。
從轉化的細胞群中分離帶有目的基因的轉化子,是基因克隆和工程操作中極為重要的環節,其工作的難易在很大程度上取決於所采用的基因克隆的方法。目標克隆的篩選可以根據載體類型、受體細胞特性的變化、外源DNA分子本身的特性等,采用不同的重組子篩選與鑒定方法。常用的方法主要有:遺傳學檢測法、核酸分子雜交檢測法、物理檢測法、免疫化學檢測法與核酸序列測序分析法等。
遺傳學檢測法實際上就是指利用機體遺傳組成與環境相互作用所產生的外觀或其他特征來對重組子進行篩選的方法,因此也稱為表型篩選法。這種篩選法對具有明顯形態學特征或比較容易檢測的生化特性的基因篩選是非常有效的,比如營養缺陷型相關的基因和抗生素抗性基因等。該方法要求宿主為不攜帶該目的基因或是該基因的缺失突變體。這裏講的供篩選用的表型特征來自兩個方麵:一個是克隆載體分子提供的,這是主要的和應用最多的;另一方麵,插入的外源DNA序列也能夠提供表型特征以供篩選,相對來說數量要少一點。因此,遺傳學檢測法可分為根據載體表型特征和根據插入序列的表型特征選擇重組子兩種方法。
1.根據載體表型特征選擇重組體分子的直接選擇法
目前,常用的基因工程載體在構建時,載體分子上通常攜帶了一個或多個選擇性遺傳標記基因,轉化或轉染宿主細胞後可以使後者呈現出特殊的表型或遺傳學特性。根據載體分子所提供的表型特征,可以進行轉化子或重組子的篩選,這種選擇重組體DNA分子的遺傳選擇法,可適用於大量群體的選擇,它能夠在很短的時間內從細胞群體中直接選擇出重組子,因此是一種比較簡單而又十分有效的方法。
質粒以及柯斯載體往往具有抗藥性標記或營養缺陷型標記,而對於噬菌體載體來說,噬菌斑的形成或顯色反應則是它們自我選擇的特征,這就為重組子的篩選提供了方便。
抗藥性篩選主要是指受體細胞不抗藥而載體分子具有抗藥性,將轉化後的細胞塗到含有抗生素的培養基平板上進行篩選,能在這種培養基上生長的就是轉化子。營養缺陷型篩選主要是指受體細胞不能合成某種必需的營養物質,而載體分子卻攜帶有合成這種營養物質的基因,將轉化後的細胞塗到不含這種營養物質的培養基平板上進行篩選,能在其上生長的菌落則認為是轉化子。
上麵所說的抗藥性篩選與營養缺陷型篩選方法雖然能夠篩選到包含載體分子的轉化子,但並不能區分開含有空載體的轉化子與含有重組子的轉化子。因此,篩選出的細胞群中仍然混有大量的由載體自連產生的假陽性克隆。為了進一步篩選出真正含有重組子的轉化子,在實際操作中,往往采用抗藥性標記插入失活選擇法與β半乳糖苷酶顯色反應選擇法等方法來進行篩選。
(1)抗藥性標記插入失活選擇法 目前常用的載體上的抗性基因內往往都帶有限製性內切酶的識別位點,當用某種限製性內切酶將其切開後,並在此位點插入外源目的DNA片段時,載體上的這個抗性基因就失去了相應的抗藥性功能,由抗性變為了敏感,這就是所謂的插入失活效應。因此,當此插入外源DNA的重組載體轉化宿主菌並在含有抗生藥物的選擇性培養基平板上培養時,根據其對該藥物的敏感性,便可篩選出重組轉化子。這種方法就是用來檢測外源DNA插入的一種通用的方法,即抗藥性標記插入失活選擇法。