第34章 外源基因在大腸杆菌中的表達(3)(1 / 3)

因為lac啟動子具有上述可控性,所以最早期研究中常用來構建表達載體,構建時,將Plac 連同其下遊編碼β半乳糖苷酶的Z 基因一起構建到載體上,並且在Z 基因中設立多克隆位點,供目的基因插入。Placuv5是以Plac為啟動子的改造形式,其起始效率比原型高,培養基中加入X‐gal顯色劑及IPTG誘導物,未插入目的基因時,IPTG誘導物誘導阻遏蛋白失活,結構基因Z基因表達,產生β半乳糖苷酶,與培養基中的X‐gal顯色劑反應呈現藍色菌落;當插入了目的基因破壞了Z基因的結構時,可使重組克隆表現為無色菌落,利用這種特點,容易進行重組子的篩選。

8.2.2trp啟動子和tac啟動子的表達載體色氨酸操縱子(tryptophane operon),又稱trp操縱子,負責色氨酸的生物合成,當培養基中有足夠的色氨酸時,這個操縱子自動關閉,缺乏色氨酸時操縱子被打開,trp基因表達,色氨酸或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程(而不是誘導過程)中起作用。由於trp體係參與生物合成而不是降解,所以它不受葡萄糖或CAP‐cAMP的調控。

色氨酸的合成分5步完成,每個環節需要一種酶,編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起,被轉錄在一條多順反子mRNA上,分別以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表,它們分別編碼鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉移酶、鄰氨基苯甲酸異構酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油3磷酶合成酶。trpE 基因是第一個被翻譯的基因。trp操縱子中產生阻遏物的基因是trpR,該基因距trp基因簇很遠,後者在大腸杆菌染色體圖上25min 處,而前者則位於90min 處。在65min處還有一個trpS(色氨酸tRNA合成酶),也參與trp操縱子的調控作用。

trp操縱子的另一個調控方式是衰減(attenuation)機製,如圖85所示,衰減子位於結構基因E 和操縱基因(O)之間的L 基因中。大腸杆菌在無色氨酸的環境下,L基因和結構基因能轉錄產生具有6700個核苷酸的全長多順反子mRNA,當細胞內色氨酸增多時,結構基因轉錄受到抑製,但L 基因轉錄的前導mRNA(140個核苷酸)並沒有減少,這部分轉錄物稱為衰減子轉錄物。衰減子轉錄物中具有4段特殊的序列,片段1和2、2和3、3和4能配對形成發夾結構,而形成發夾結構能力的強弱依次為片段1/2> 片段2/3> 片段3/4。片段3和4所形成的發夾結構之後緊接著寡尿嘧啶,出現不依賴於ρ 因子的轉錄終止信號。

這4個片段形成何種發夾結構,是由L 基因轉錄物的翻譯過程所控製的。L 基因的部分轉錄產物(含片段1)編碼14個氨基酸,其中含有兩個相鄰的色氨酸密碼子。這兩個相鄰的色氨酸密碼子在原核生物中轉錄與翻譯的偶聯是產生衰減作用的基礎。L 基因轉錄不久核糖體就與mRNA結合,並翻譯L 短肽序列。細胞內有色氨酸時,形成色氨酸tRNA,核糖體翻譯可通過片段1,並通過片段2。因遇到翻譯終止密碼,核糖體在到達片段3之前便從mRNA上脫落。在這種情況下,片段1/2和片段2/3之間都不能形成發夾結構,而隻有片段3/4形成發夾結構,即形成轉錄終止信號,從而導致RNA聚合酶作用停止。如果細胞內沒有色氨酸,色氨酰tRNA缺乏,核糖體就停止在兩個相鄰的色氨酸密碼的位置上,片段1和2之間不能形成發夾結構,片段2和3之間可形成發夾結構,則片段3/4就不能形成轉錄終止信號,後麵的基因得以轉錄。

色氨酸操縱子中的操縱基因和衰減子可發起雙重負調節作用。衰減子可能比操縱基因更靈敏,隻要色氨酸一增多,即使不足以誘導阻遏蛋白結合操縱基因,也足可以使大量的mRNA提前終止。反之,當色氨酸減少時,即使失去了誘導阻遏蛋白的阻遏作用,但隻要還可以維持前導肽的合成,仍繼續阻止轉錄。這樣可以保證盡可能充分地消耗色氨酸,使其合成維持在滿足需要的水平,防止色氨酸堆積和過多地消耗能量。同時,這種機製也使細菌能夠優先將環境中的色氨酸消耗完,然後開始自身合成。