2.表達GST 融合蛋白的表達載體
GST 表達載體在啟動子tac 和多克隆位點之間加入了兩個與分離純化有關的編碼序列，其一是穀胱甘肽轉移酶基因，其二是凝血蛋白酶（thrombin）切割位點的編碼序列。當外源基因插入到多克隆位點後，可表達出由三部分序列組成的融合蛋白。GST是來源於血吸蟲的小分子酶（26kDa），在E.coli 易表達，在融合蛋白狀態下保持酶學活性，對穀胱甘肽有很強的結合能力。將穀胱甘肽固定在瓊脂糖樹脂上形成親和層析柱，當表達融合蛋白的全細胞提取物通過層析柱時，融合蛋白將吸附在樹脂內，其他細胞蛋白就被洗脫出來。然後再用含遊離的還原型穀胱甘肽的緩衝液洗脫，可將融合蛋白釋放出來。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可獲得純化的目標蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位點外，其他還有Ⅹa因子（factor Ⅹa）和腸激酶。
穀胱甘肽轉移酶又稱為配偶體，是指融合蛋白中與目標蛋白質連接的別種蛋白質組分。
常見的配偶體除了穀胱甘肽轉移酶外還包括葡萄球菌蛋白質A（SPA）、鏈球菌蛋白質G（SPG）、麥芽糖結合蛋白（MBP）、硫氧還蛋白等。配偶體的存在為融合蛋白質提供了許多便利，諸如阻止包涵體的形成，改善了蛋白質的折疊性能，限製了蛋白質的酶解活性。應用附加的親和標記物，如FLAG、His6、c-Myc 多肽等可簡化一般性的蛋白質的檢測與純化程序。
8.4提高外源基因表達效率的方法
研究者在大腸杆菌中合成某種特殊的真核生物的蛋白質，若基因的表達量僅僅停留在實驗室檢測水平是不夠的，要滿足商品生產的需要，大量地獲得目的蛋白，須高效率地表達外源基因。影響外源基因的表達的因素有很多，如啟動子強度、DNA轉錄起始區的序列、密碼子的選擇等。提高外源基因的表達從以下幾個方麵考慮，mRNA分子的二級結構、5′UTR 的序列、轉錄的終止、質粒的拷貝數、宿主細胞的特性、目的蛋白的穩定性及其對宿主細胞的影響等等。這些因素都會影響外源基因在宿主細胞中的表達量。提高外源基因的表達效率可以從以下幾個方麵著手。
8.4.1外源基因的有效轉錄與外源基因高效表達
1.外源基因
外源基因不能帶有內含子序列，因為原核細胞沒有能夠對pre‐mRNA進行剪接修飾的係統，所以獲得目的基因的mRNA後反轉錄成cDNA後進行操作。考慮大腸杆菌宿主細胞的密碼子偏好問題，大腸杆菌基因對密碼子的使用表現了較大的偏愛性，在幾個同義密碼子中往往隻有一個或兩個被頻繁地使用，其他不常使用的被稱為稀有密碼子，稀有密碼子的tRNA在細胞中的豐度很低，外源基因的mRNA的翻譯過程中，往往會由於外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細胞內稀有密碼子的tRNA供不應求，影響翻譯的效率，因此，對目的基因可以通過點突變的方法，將外源基因中的稀有密碼子轉換為在大腸杆菌細胞中高頻出現的同義密碼子。
2.提高質粒拷貝數及穩定性
基因的拷貝數越大，表達的強度必定越高，除了上述方法外，提高基因劑量的有效方法，將基因克隆到高拷貝數的質粒上。質粒分離還存在著分離的不穩定性，如果細菌由於產生出某種突變而失去了重組質粒，或者經過結構的重排使重組基因無法表達，或者質粒的拷貝數大大降低，那麼突變的菌株即有較高的生長速度，迅速生長的菌株稱為培養物中的優勢菌株。由於缺陷型分配可造成質粒分離的不穩定性。
3.高效表達載體
構建高效率的表達載體，著重於轉錄起始的啟動效率及翻譯的起始效率兩方麵。①引入強啟動子，啟動子的效率與－10區、－35區及兩個區域之間的距離有關，一般來說－10區、－35區堿基組成越接近保守序列，及兩者之間的距離越接近17bp，啟動效率越強，但具體實驗還須根據不同的啟動子通過點突變的方法來確定最佳的啟動子效率；②調整SD序列，使SD序列完全與16S rRNA的反SD序列互補配對，並且根據外源基因的表達不同情況，調整SD序列與起始密碼子ATG 之間的距離及堿基的種類，設法防止轉錄後的mRNA的5′UTR 區形成二級結構。
在原核生物中，最理想的強啟動子應該是：在發酵的早期階段，表達載體的啟動子被緊緊地阻遏，這樣可以避免表達載體不穩定、細胞生長緩慢或由於產物表達而引起細胞死亡等問題；當細胞數目達到一定的密度，通過各種誘導（如溫度、誘導物等）使阻遏物失活，RNA聚合酶快速啟動轉錄。Lac、Trp、λPL、λPR、Tac、PhoA 等都屬於原核細胞的可調控強啟動子。T7噬菌體啟動子則是另一種類型的啟動子，由於其隻為T7噬菌體RNA聚合酶所識別，被T7噬菌體RNA聚合酶所起始的轉錄是非常活躍的，在1～3h 之內目標基因的RNA轉錄物可達rRNA水平，而宿主細胞RNA聚合酶不能識別它起始轉錄。由於T7噬菌體RNA聚合酶幾乎能完整地轉錄在T7啟動子控製下的所有的DNA序列，所以近年來很多實驗室開始選用T7噬菌體啟動子對外源基因進行高水平表達。所以無論是可誘導的（inducible）還是組成型的（constitutive）啟動子，在適當的條件下都可以使外源基因高水平表達。