目的與要求
1.掌握細菌、放線菌、酵母菌、黴菌細胞的形態構造、菌落特征和繁殖特點。
2.掌握觀察細菌、放線菌、黴菌、酵母菌形態的基本方法和革蘭氏染色技術，熟練使用光學顯微鏡。
3.了解食品中常見的微生物種類及它們的主要生物學特征、噬菌體的形態構造特點及繁殖方式。
4.了解微生物的分類方法和分類依據。
細菌是自然界中分布最廣、種類最多，與人類關係極為密切的一類微生物，是我們研究的主要對象。
一、細菌的形態
（一）個體形態
細菌是單細胞原核生物，基本形態可分為球菌、杆菌、螺旋菌三種。
1．球菌
細胞呈球形或近球形，分裂後產生的子細胞由於分裂麵的不同而有不同的排列方式。分裂後子細胞分散而單獨存在的，稱為單球菌，如尿素微球菌；分裂後子細胞成雙排列的，稱為雙球菌，如肺炎雙球菌；分裂是沿一個平麵進行，分裂後子細胞排列成鏈狀的，稱為鏈球菌，如乳鏈球菌；沿兩個相垂直的平麵分裂，分裂後每四個子細胞在一起呈田字形的，稱四聯球菌；經過三次在相互垂直的平麵上分裂，分裂後8個子細胞疊在一起呈立方體的就稱為八疊球菌，如尿素疊球菌；許多細胞排列呈葡萄狀的則稱為葡萄球菌，如金黃色葡萄球菌。
2.杆菌
菌體呈杆狀，直或稍彎曲。根據杆菌的長短不同可分為長杆菌、短杆菌、球杆菌；根據菌體兩端的不同形狀和排列方式的特點又分為棒狀杆菌、雙杆菌、鏈杆菌；根據形成芽孢的能力又分為芽孢杆菌和無芽孢杆菌。
3.螺旋菌
細胞形體呈彎曲狀。根據其彎曲程度不同又分為弧菌和螺旋菌。菌體彎曲呈弧形或逗號形的稱為弧菌，如霍亂弧菌；菌體回轉而呈螺旋狀的稱為螺旋菌，如紅色螺旋菌。
細菌的形態與培養溫度、培養基的成分、培養基的濃度、培養的時間有關。
細菌的個體非常微小，通常以微米（μm）作為測量單位。球形菌的大小以直徑表示，杆菌、螺旋菌的大小以其長×寬表示，螺旋菌的長度是由自然彎曲狀的長度來計算。
大多數球菌的直徑為0.20～1.25μm；杆菌的大小為（1～5）μm×（0.5～1）μm；螺旋菌為（0.3～1）μm×（1～50）μm。
細菌的大小因種類不同而有所差別，如產芽孢的杆菌大於不產芽孢的杆菌。
（二）菌落特征
把單個的微生物細胞接種到適合的固體培養基上，在適宜的環境條件下生長繁殖，形成一個肉眼可見的細胞群體，我們把這個細胞群體稱為菌落。
細菌菌落特征包括菌落大小、形狀、光澤、顏色、硬度、透明度等。不同菌種其菌落特征不同，同一菌種因不同生活條件其菌落形態也不盡相同，但同一菌種在相同培養條件下所形成的菌落形態是一致的，所以菌落形態特征對菌種的鑒定有一定的意義。細菌菌落較小，常表現為濕潤、黏稠、光滑、較透明、易挑取、質地均勻。球菌常形成隆起的菌落，有鞕毛細菌常形成表麵幹燥皺折、邊緣不規則的菌落，有莢膜的細胞組成的細胞表麵透明、邊緣光滑整齊，能產色素的細菌菌落還顯出各種顏色。
液體培養菌體生長後的特征一般包括表麵生長、混濁程度、沉澱形態、有無氣體產生、顏色變化等。
二、細菌的細胞構造
細菌的細胞結構，可分為基本結構和特殊結構。基本結構指任何細菌細胞所具有的結構，包括細胞壁、細胞膜、細胞質、核質體和內含物。特殊結構指某些細胞所特有的結構，如鞭毛、菌毛、莢膜、芽孢等。
（一）基本結構
1.細胞壁
細胞壁是包在細胞表麵較為堅韌略具彈性的結構，具有保護細胞和保持細胞外形的功能，具有半滲透性，能維持細菌與外界的物質交換。各種細菌的細胞壁厚度不等，一般在10～80nm之間。
細菌細胞壁的基本骨架是肽聚糖層，不同種類細菌的細胞壁肽聚糖的結構與組織不完全相同。采用革蘭氏染色技術法可將所有的細菌分為革蘭氏陽性（G+）、革蘭氏陰性(G-)兩種類型。革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分是肽聚糖（黏肽），革蘭氏陰性菌細胞壁中含有脂多糖。
2.細胞膜
細胞膜又稱為細胞質膜，厚為5～8nm，是圍繞細胞質外麵的雙層膜結構。它控製細胞體內外物質的交換滲透作用，使細胞具有選擇吸收性能，也是許多生化反應的重要部位，主要成分是類脂和蛋白質。
3.核質體
細菌沒有真正的細胞核，僅有緊密結集的絲狀染色質，稱為核質體,它的主要成分是DNA，其功能是記錄和傳遞遺傳信息。
4.細胞質及內含物
細胞質是位於細胞膜內的無色透明黏稠狀膠體，是細菌細胞的基礎物質，其基本成分是水、蛋白質、核酸和脂類，也含有少量的糖和無機鹽類。
細胞質是細胞的內在環境，具有生命活動所有的各種特性，含多種酶係統，是細胞新陳代謝的主要場所。
細胞質內含有多種物質，它們是細胞的貯藏物質或代謝產物，化學成分主要是糖類、脂類、含氮化合物以及無機物等。
由於細菌的不同發育階段以及所處環境條件的差異，各種菌中甚至在同一菌中細胞的內含物和數量是不同的，但是同一菌種在相同的環境條件下，常含有一定的內含物，這一點有助於細菌的鑒定。
（二）特殊結構
1.鞭毛
鞭毛是細菌的運動器官，是由菌體伸展到體外的纖細彎曲的絲狀物。
鞭毛的長度可超過菌體若幹倍，但其直徑卻很小，為10～20nm。由於超過了光學顯微鏡的可視度，隻有電子顯微鏡直接觀察或通過特殊的鞭毛染色後才能看見。
大多數球菌不生鞭毛，杆菌中有的生鞭毛有的不生鞭毛，弧菌與螺旋菌都生鞭毛。
鞭毛的數量及著生的位置是細菌分類的依據，根據鞭毛著生的情況可分為如下幾類：
單毛菌：①偏端單生鞭毛菌：在菌體的一端生一根鞭毛，如霍亂弧菌
②兩端單生鞭毛菌：在菌體兩端各具一根鞭毛，如鼠咬熱螺旋體
叢毛菌：①偏端叢生鞭毛菌：在菌體的一端生一束鞭毛，如銅綠假單胞杆菌
②兩端叢生鞭毛菌：在菌體兩端各具一束鞭毛，如紅色螺菌
周毛菌：菌體周身都生有鞭毛，如傷寒杆菌。
鞭毛的主要化學成分是蛋白質，還有少量的糖和脂類。當細菌生長條件不利時，往往是不產生鞭毛或鞭毛脫落下來，衰老的細胞，鞭毛也易脫落而不能運動。
2．菌毛
許多革蘭氏陰性菌的菌體上，有一種數量較多，較鞕毛短而直，直徑比鞕毛細的細絲，叫菌毛。菌毛不是運動器官，但可增強細菌的附著能力，菌毛的主要成分是蛋白質。
3．莢膜
某些細菌在一定條件下可向細胞壁表麵分泌一層疏鬆透明、黏液狀或膠質狀的物質，形成較厚的膜，稱為莢膜。也有些細菌的莢膜連在一起，其中包含著多個細胞，稱為菌膠團。
莢膜主要是由90%水分和多糖或多肽聚合物組成。產莢膜的細菌由於有黏液物質，在固體瓊脂培養基上形成的菌落，表麵濕潤、有光澤、黏液狀，稱為光滑型（S-型）菌落，如腸膜狀明串珠菌。而無莢膜細菌形成的菌落表麵幹燥、粗糙，稱為粗糙型菌落（R-型），如肺炎雙球菌。
莢膜的作用是保護菌體在機體內不易被白細胞吞噬，使細菌具有比較強的抗幹燥作用。當營養物質缺乏時可作為碳源及能源而被利用，某些細菌由於莢膜的存在而具有毒性，如具有莢膜的肺炎雙球菌毒性很強，當失去莢膜時，則失去毒性。因此莢膜能增強細菌的致病力，如S型肺炎雙球菌能引起人體疾病，而R型肺炎雙球菌是非致病性的。
莢膜需用特殊的莢膜染色技術才能觀察清楚。
4．芽孢
芽孢是細菌在某一生活史的一定階段，菌體失去大部分水分，胞漿濃縮，形成的一個圓形、橢圓形或圓柱形的抗熱性休眠體。它們是由細菌DNA和外部多層蛋白質及肽聚糖包圍而構成，產生芽孢的細胞稱為孢子囊。芽孢具有較強的抗熱性和抗幹燥、抗輻射、抗酸及抗化學消毒劑等特性。如肉毒梭狀芽孢杆菌，pH中性條件下，幹熱180℃、15min；濕熱100℃、5h；高壓滅菌120℃、20min方可消滅。5%苯酚、20%甲醛，24h才能將其殺滅。了解芽孢抗熱的特性，對製定培養基、食品以及其他易於腐敗的物品的滅菌條件是十分重要的。
芽孢的有無及形成的位置、形狀、大小因菌種而異，是鑒定細菌的依據。例如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌等的芽孢位於菌體的中央，卵圓形，比菌體小；丁酸梭菌等的芽孢位於菌體中央，橢圓形，直徑比菌體大；而破傷風杆菌的芽孢位於菌體的一端，直徑比菌體大，孢子囊呈鼓槌狀。
芽孢的壁厚、折光性強，在顯微鏡下觀察芽孢為透明體，不易著色，要用特殊的染色法才能看到。
三、細菌的繁殖方式
細菌主要是以簡單的無性二分裂方式繁殖。分裂時，首先菌體伸長，核質體分裂，菌體中部的細胞膜以橫切方向形成隔膜，將細胞質分為兩部分。細胞壁向內生長把橫膈膜分為兩層，形成子細胞的細胞壁，然後細胞分離成兩個菌體。
四、細菌的染色與製片
細菌個體微小而透明，在普通光學顯微鏡下，要看清其大小、形態和結構必須借助於染色法使細菌著色後，與背景形成鮮明的對比，才便於在顯微鏡下進行觀察。
（一）染色的基本原理
染色過程是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等。化學因素則是根據細胞物質和染料的不同性質而發生各種化學反應。如細胞酸性物質對於堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，細胞堿性物質對酸性染料較易於吸附。若要讓酸性成分吸附酸性染料或堿性成分吸附堿性染料，則必須改變染色環境的pH。
（二）染料的種類和選擇
1.堿性染料
這類染料電離後染料離子帶正電，可與酸性物質結合成鹽。微生物實驗室一般常用的堿性染料有美藍、甲基紫、結晶紫、堿性複紅、中性紅、孔雀綠和番紅等，因細胞含有兩性物質（蛋白質和核酸），其等電點較低，pH在2～5之間，故在中性、堿性和弱酸性溶液中都帶負電荷。帶負電荷的細菌和帶正電荷的堿性染料容易結合，所以在細菌學上多用堿性染料。堿性染料主要染細胞核和異染顆粒等酸性細胞結構。
2.酸性染料
這類染料電離後染料離子帶負電。如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性複紅等，可與堿性物質結合成鹽。當培養基因糖類分解產酸使pH下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。酸性染料主要用於染細胞質。
3.複合染料
堿性染料與酸性染料的複合物稱為複合染料，如伊紅美藍、伊紅天青。
4.單純染料
這類染料的化學親和力低，不能和被染的物質生成鹽，其染色能力視其是否溶於被染物而定，因為它們大多數都屬於偶氮化合物，不溶於水，但溶於脂肪溶劑中，如紫丹類的染料。
（三）影響染色的因素
細胞膜的滲透性，膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定的作用。此外，培養基的組成、菌齡、染色液中電解質含量、pH、溫度、藥物的作用等，都能影響細菌的染色情況。
（四）染色的方法與基本步驟
1．染色的方法
微生物染色方法一般分為單染色法和複染色法兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。複染色法是用兩種或兩種以上染料，有協助鑒別微生物的作用，又稱鑒別染色法。常用的複染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細胞各部分結構的（如芽孢、鞭毛、細胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革蘭氏染色法。
(1)單染色法是指用一種染料對菌體著色的方法。它可以幫助觀察菌體形態，但不能顯示菌體結構，不能鑒別微生物。如細菌、酵母菌、黴菌的形態觀察采用這種方法。
在染色過程中常加入媒染劑如碘、石炭酸、明礬等或用加熱的方法，以增加染料對細菌的親和力。
(2)複染色法是指用兩種或兩種以上的染料對菌體著色的方法。它可以幫助鑒別一些微生物，也可以觀察某些菌體結構，如革蘭氏染色法和抗酸性染色法。
①革蘭氏染色法：革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫師Gram創立。
此法的染色步驟是先用結晶紫或龍膽紫染液加於已固定的細菌塗片標本上使之著色，其次加碘作媒染劑，再用酒精脫色，最後用複紅或沙黃染液複染。革蘭氏染色法能將細菌分成兩大類：染色後細菌能保留結晶紫而呈紫色者，為革蘭氏陽性菌（可寫做G+）；細菌被酒精脫去紫色染料而被複紅或沙黃染成紅色者，為革蘭氏陰性菌（可寫做G-）。大多數病原性球菌屬於革蘭氏陽性菌，大多數病原性杆菌為革蘭氏陰性菌，病原性弧菌是革蘭氏陰性菌。
②抗酸性染色法：抗酸性染色法也是一種常用的鑒別染色法。主要染色步驟是將細菌塗片固定後，以石炭酸複紅染液加溫進行染色，然後用含酸的酒精脫色，最後用美藍染液複染。結核杆菌和麻風杆菌等有抵抗酸性酒精脫色的能力被染成紅色，故稱為抗酸菌，其他細菌都被染成藍色為非抗酸菌。
用複染色法染色時，常用酒精、丙酮或酸類作為脫色劑，以檢查染料和細菌結合的牢固程度，最後用與初染色劑顏色有鮮明對比的染料進行複染，以便進行觀察與區別細菌種類。
(3)特殊染色法是指對不同的結構，采用不同的染色方法，可用於觀察菌體的不同結構。如鞭毛染色法、莢膜染色法、芽孢染色法、異染顆粒染色法。
(4)熒光染色法除上述染色法外，還可以用熒光染料，如金胺。此類染料溶於水中，在紫外線照射下能激發出熒光，也分為酸性染料和堿性染料兩種。細菌用熒光染料染色後在熒光顯微鏡下檢查，可在黑的背景中觀察到細菌發出明亮的熒光。用熒光染色法檢查細菌有加快檢查速度和提高陽性率的優點。
2．染色的基本步驟
(1)塗片在潔淨無油脂的載玻片上加一滴生理鹽水。用經火焰滅菌的接種環取標本少許，放在鹽水滴內研勻塗成薄的菌膜。若為液體標本，直接挑起少許塗抹即可。若為多個標本一起染色時，可先用蠟筆在玻片上劃數格，並於玻片的背麵標明標本編號。
(2)幹燥一般在室溫中自然幹燥，若需加速幹燥，可在火焰上方的熱空氣中加溫幹燥，但勿緊靠火焰，以防標本烤枯，不易觀察。
(3)固定固定的目的是使細菌的細胞質凝固，殺死細菌，使菌體與玻片粘附得較牢，以及改變菌體對染料的通透性。一般係用加熱法，將塗片迅速通過火焰2～3次，以玻片反麵觸及皮膚，熱而不燙手為度。
(4)初染將塗片置染色架上，滴加染液，以覆蓋標本為度。
(5)媒染主要為增強菌體與染液間的作用力。其方法有用熱、金屬鹽、碘液等。
(6)脫色其目的在於測知染料與被染物之間結合的牢固程度，具有鑒別細菌的作用。將脫色劑滴加於經染色的標本上，作用一定時間後除去脫色劑。
(7)複染目的是使已脫色的菌體重新染上與前染液顏色呈鮮明對比的顏色。
（五）製片的方法
製片的方法有多種，不同的微生物采用不同的製片方法，但一般均製作在載玻片上。下麵介紹幾種常用的製片方法。
1.塗片法
在一潔淨的載玻片中央滴一滴生理鹽水或蒸餾水，用無菌的接種環在固體培養基表麵取少許菌體，塗成薄片（若為液體培養基，則滴稀釋的菌懸液一滴即可），自然幹燥後通過火焰2～3次進行固定，再進行染色即可。
2.壓滴法
在一潔淨的載玻片中央滴加一滴染液，挑菌於染液中塗勻（或直接滴一滴菌懸液），取一潔淨蓋玻片，一端置於載玻片液滴邊緣，緩緩壓下即成。注意勿使液滴外溢且要避免氣泡產生。
3.懸滴法
將含菌懸液滴於一潔淨的蓋片上，再將蓋片翻轉，置於凹孔載玻片上，使液滴懸於凹孔室即可。注意液滴不得與凹玻片接觸。
五、食品工業中常見的細菌
（一）醋酸杆菌屬
此菌屬為革蘭氏陰性杆菌。細胞從橢圓到杆狀，直或稍彎曲，單獨、成對或鏈狀生長。周生或側生鞭毛，運動或不運動，無芽孢，專性好氧，菌落灰白色，最適生長溫度為25～30℃，最適pH5.4～6.3。該菌屬能將乙醇氧化為醋酸，並可將醋酸和乳酸氧化為二氧化碳和水。生產中發現，醋酸杆菌在葡萄酒的貯藏過程中，能夠在半厭氧和厭氧條件下生存，其危害不單是生成醋酸，同時還能代謝葡萄酒中的碳水化合物、甘油、糖醇類物質和有機酸等其他成分。另外，葡萄漿果上生長的醋酸杆菌能夠改變葡萄汁的組成，影響酒精發酵過程中酵母菌的生長繁殖。
（二）埃希氏杆菌屬
此菌屬為革蘭氏陰性菌。細胞呈杆狀，單個或成對存在。運動者周身鞭毛，無莢膜，無芽孢，兼性厭氧。埃希氏杆菌屬中的代表菌是大腸杆菌，多具鞭毛，存在於溫血動物的腸道內，是人和動物腸道中正常菌群之一。絕大多數大腸杆菌在腸道內無致病性，極少部分可產生腸毒素等致病因子引起腸道外感染。此外，該菌大多具有組氨酸脫羧酶活性，汙染食品後，可在食品中產生組胺，引起過敏性食物中毒。大腸杆菌是食品中常見的腐敗菌，也是食品和飲用水的糞便汙染指示菌之一。