同其他色譜過程一樣，高效液相色譜也是溶質在固定相和流動相之間進行的一種連續多次的交換過程，它借溶質在兩相間分配係數、親和力、吸附能力、離子交換或分圖5-1液相色譜分離過程子大小不同引起的排阻作用差別使不同溶質進行分離。在高效液相色譜過程中的流動相是液體（溶劑），又叫洗脫劑或載液。開始時溶質加在柱頭，隨流動相一起進入色譜柱，接著在固定相和流動相之間分配。分配係數小的組分(如組分A)，不易被固定相滯留，流出色譜柱較早；分配係數大的(如組分C)在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。若一個含有多組分的混合物進入色譜係統，則混合物中各組分便按其在兩相間分配係數的不同先後流出色譜柱。不同組分在色譜過程中分離情況首先取決於各組分在兩相間的分配係數、吸附能力、親和力等的差異。不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，展寬的程度與溶質在兩相的擴散係數、固定相填料的顆粒大小、填充情況和流動相流速等有關。
一、高效液相色譜的類型
（一）體積排阻色譜
體積排阻色譜（Size Exclusion Chromatography， SEC）是一種純粹按照溶質分子在流動相溶劑中的體積大小分離的色譜法。填料具有一定範圍的孔尺寸，大分子進不去而先流出色譜柱，小分子後流出。在用水係統作為流動相的情況下，又稱為凝膠過濾色譜（GFC）。用於生物大分子分離的傳統SEC填料主要是多糖聚合物凝膠，隻能在低壓下進行慢速分離。目前在很大程度上被微粒型交聯的親水凝膠（如交聯瓊脂糖Superose 6和Superose12）、乙烯共聚物（如TSK-Gel PW）和親水性鍵合矽膠（如Zorbax GF 250和450）所取代。因填料的孔徑大小不同，SEC能分離的相對分子質量級範圍在1萬到200萬之間。對於分析分離或實驗室小規模製備，平均粒度在3～13μm的規格較適用，有良好的柱效率和分離能力。但對大規模的製備分離和純化，因要考慮成本和滲透性，可以采用較粗的粒度。體積排阻色譜一般用作原料液的初分離，獲取幾個分子量級，供進一步分離純化使用。
（二）離子色譜
離子色譜法（Ion Chromatography，IC）是20世紀70年代中期發展起來的一項新的液相色譜技術，主要用於離子型化合物的分析，目前已成為分析化學領域中發展最快的分析方法之一。按照分離機理的不同，離子色譜法可分為離子交換色譜（IEC）、離子排斥色譜（ICE）和流動相離子色譜（MPIC）。IEC的分離機理主要是離子交換，根據固定相離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，對待測離子進行分離，一般用於親水性陰離子、陽離子和碳水化合物的分離，因而又分為陰離子交換色譜法、陽離子交換色譜法等；ICE的分離機理包括Donnan排斥、空間排斥和吸附，是利用待測物質與固定相之間的非離子相互作用進行分離的，其分離柱一般是填充高容量的陽離子交換樹脂，樹脂表麵鍵合磺酸基團，當水分通過分離柱時，磺酸基團周圍形成一個水合層，在水合層和淋洗液之間形成一個類似Donnan膜的負電層，非離子型的組分沒有受到Donnan的排斥而進入樹脂微孔，完全解離的物質如鹽酸由於帶有負電荷而受到排斥，無法在分離柱上保留，從而使物質分離，一般用於無機弱酸、有機酸、氨基酸、醛、醇的分離；MPIC的分離機理主要是離子對的吸附，用高交聯度、高比表麵積的中性無離子交換功能基的聚苯乙烯大孔樹脂為柱填料，使用強酸和強堿性的離子對試劑淋洗液和化學抑製型電導檢測器，將反相離子對色譜法的高分離效率和高選擇性與化學抑製型電導檢測器測定離子的高靈敏度結合起來，適合於疏水性陰離子、陽離子和過渡金屬配合物的分離。
（三）反相色譜
反相色譜（Reversed Phase Chromatography， RPC）是基於溶質、極性流動相和非極性固定相表麵間的疏水效應建立的一種色譜模式。通常是指以具有非極性表麵的擔體為固定相，以比固定相極性更強的溶劑係統為流動相的色譜分離技術。一個典型的例子就是在十八烷基矽膠鍵合相上用甲醇水混合溶劑衝洗。任何一種有機分子的結構中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高。這在高效液相色譜中是應用最廣的一種分離模式。在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液，並加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機改性劑。大量使用的填料為孔徑在30nm以上的矽膠烷基鍵合相，除此之外也有少量高聚物微球。實驗表明，烷基鏈長對蛋白質的反相保留沒有顯著的影響，但在蛋白質的活性回收上短鏈烷基（如C4，C8，苯基）和長鏈烷基（如C18、C22）反相填料是有區別的。表現在烷基鏈越長，固定相的疏水性越強，因而為使蛋白質較快洗脫下來，需要增加流動相的有機成分。過強的疏水性和過多的有機溶劑會導致蛋白質的不可逆吸附和生物活性的損失。總起來說，在烷基鍵合矽膠上的反相色譜，由於其柱效高、分離度好、保留機製清楚，是蛋白質的分離、分析、純化中廣泛使用的一種方法。近年來在農業和食品科學領域又有一些新的應用。
（四）疏水作用色譜
疏水作用色譜（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）的原理與反相色譜相同，區別在於HIC填料表麵疏水性沒有RPC強。所用填料同樣分有機聚合物（交聯瓊脂糖Superose 12，TSK-PW，乙烯聚合物等）和大孔矽膠鍵合相兩類。疏水配基一般是低密度分布在填料表麵上的苯基、戊基、丁基、丙基、羥丙基、乙基或甲基，也有的是在矽膠表麵鍵合聚乙二醇。流動相一般為pH 6～8的鹽水溶液，作降濃度梯度淋洗，在高鹽濃度條件下，蛋白質與固定相疏水締合；濃度降低時，疏水作用減弱，逐步被洗脫下來。和普通反相液相色譜相比，這種表麵帶低密度疏水基團的填料對蛋白質的回收率高，蛋白質變性可能性小。由於流動相中不使用有機溶劑，也有利於蛋白質保持固有的活性。
（五）親和色譜
親和色譜（Affinity chromatography）是利用生物大分子和固定相表麵存在某種特異性吸附而進行選擇性分離的一種生物大分子分離方法。通常是在載體（無機或有機填料）表麵先鍵合一種具有一般反應性能的所謂間隔臂（如環氧、聯氨等），隨後再連接上配基（如酶、抗原或激素等）。這種固載化的配基隻能和與其有生物特異性吸附的生物大分子相互作用而被保留，沒有這種作用的分子不被保留而先流出色譜柱。此後改變流動相條件（如pH或組成），將保留在柱上的大分子以純品形態洗脫下來。例如，若在間隔臂鏈段上分別反應上抗原、蛋白質A或磷脂酰膽堿，便可分離和回收到相應的抗體、免疫球蛋白或膜蛋白。親和色譜選擇性強、純化效率高，實際上也可以認為是一種選擇性過濾，往往可以一步獲得純品。
二、高效液相色譜的固定相和流動相
（一）固定相
高效色譜柱是高效液相色譜的心髒，而其中最關鍵的是固定相及其填裝技術。不同的液相色譜法所用的固定相不同。