近年來，PCR技術被大力發展和應用，許多PCR改良方法相繼出現，PCR相關技術發展很快，這些PCR改良方法主要與臨床診斷和應用有關，目前常用的幾種PCR技術主要有巢式PCR、多重PCR、增效PCR和不對稱PCR等。
一、巢式PCR
有時由於擴增模板含量太低，為了提高檢測靈敏度和特異性，可采用巢式PCR（Nested PCR，nPCR或N-PCR）。nPCR是PCR改良方法中最常用的方法。nPCR能夠極大地增加PCR擴增反應的敏感性和特異性，而這種高敏感性和高特異性是通過第二對引物(內引物)與由第一對引物(外引物)在第一輪擴增中產生的靶DNA內的序列進行退火雜交後進行的第二輪擴增而達到的。對應的序列在模板外側的引物，稱外引物（Outer-primer），互補序列在同一模板的外引物的內側引物，稱內引物（Inter-primer），即外引物擴增產物較長，含有內引物擴增的靶序列，這樣經過兩次PCR放大，可將單拷貝的目的DNA片段檢出。
nPCR優點：①克服了單次擴增“平台期效應”的限製，使擴增倍數提高，從而極大地提高了PCR擴增的敏感性；②由於模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續放大進行的可能性，保證了反應的特異性；③內側引物擴增的模板是外側引物擴增的產物，第二階段反應能否進行，也是對第一階段反應正確性的鑒定，因此可以保證整個反應的準確性及可行性。
nPCR的缺點：進行二次PCR擴增引起交叉汙染的幾率大。為了克服此缺點，可采用同一反應管中巢式PCR（one-tube nested PCR），主要利用內外引物tm值不同。外引物tm高，內引物tm低，PCR反應開始的若幹輪循環采用較高的退火溫度，內引物由於tm值低，高溫下無法與模板結合不能延伸，而外引物可與模板退火延伸，再采用較低的退火溫度進行後麵的循環，內引物則可與模板退火延伸，這樣實際上進行了二次擴增，但隻進行一次操作，可減少交叉汙染的機會。
在典型的nPCR擴增方法中，第一輪PCR擴增使用外引物擴增15～30個循環；然後將第一輪擴增產物轉移至一個新的反應管內，使用一對內引物進行第二輪擴增反應，第二輪擴增一般為15~30個循環，最後用凝膠電泳鑒定擴增產物。nPCR常用於檢測低拷貝的病原體及某些細菌。
二、逆轉錄PCR
自從1987年Powell等報道了mRNA的逆轉錄並對所合成的cDNA進行PCR擴增以後，逆轉錄PCR(RT-PCR)已經作為一種快速、敏感和特異性的技術被廣泛地用作檢測癌細胞、遺傳疾病和許多不同病原體的實驗室檢測方法，為疾病的診斷、疾病的進程、疾病愈後的判斷以及藥物的療效提供了有價值的信息。目前，RT-PCR在我國臨床分子診斷中主要用於RNA病毒的檢測。有些病毒基因組隻以RNA形式存在，而且在它們的病毒複製周期中不經過RNA逆轉錄至DNA的過程，因此檢測病毒的RNA可以診斷由這類病毒感染而引起的傳染病。另外，RNA的檢測也可以應用到鑒定含有數千個mRNA或rRNA分子的較高級微生物，如細菌和真菌。
從RNA逆轉錄至cDNA需要逆轉錄酶，然而這些酶不耐高溫，在42℃以上容易失活，並由於單鏈模板RNA易形成穩定的二級結構，以使RNA逆轉錄成為cDNA的效率變化很大。逆轉錄的最低效率隻有5%，因此逆轉錄酶的低效率是影響特異性檢測RNA靶序列的一個大障礙。1994年，已經上市的重組Tth DNA聚合酶(rTth酶)能夠同時進行逆轉錄和PCR擴增。在cDNA合成之前，高溫破壞mRNA二級結構的穩定性，使熱穩定性酶如rTth酶增加了RT-PCR檢測的敏感性而產生極其有效的逆轉錄。高溫也能夠增加逆轉錄的特異性，在高溫下隻有特異性引物與靶mRNA退火雜交。使用具有逆轉錄和DNA擴增兩種功能的酶，可以避免cDNA的轉移和降低汙染的可能性，簡化了操作過程。
三、多重PCR
普通PCR由一對引物擴增，隻產生一個特異的DNA片段。許多情況下，欲檢測的基因十分龐大，可達上千個kb，這些基因常常多處發生突變或缺失，而且這些改變相距數十至數百個kb，超過PCR擴增DNA片段的長度，欲檢測整個基因的異常改變，采用一般PCR需分段進行多次擴增，費時費力，采用多重PCR（multi-plex PCR）則可克服上述問題。多重PCR就是首先設計合成位於多個缺失好發區域兩側的引物，每對引物之間核苷酸長度盡量不同，以使擴增後電泳分析時有各自的條帶位置，然後將多對引物加入反應體係，進行常規PCR擴增，30～40個循環後，對PCR產物進行電泳檢測。如果基因某一區段缺失，則相應的電泳圖譜上此區段PCR擴增產物長度變短或片段消失，從而發現基因異常。多重PCR具有靈敏、快速的特點，特別適用於檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結果與Southern雜交結果同樣可靠，且多重PCR尚可檢測小片段缺失。