正文 PCR技術在轉基因食品檢測中的應用(1 / 3)

隨著現代生物技術的發展,轉基因食品已逐步進入普通百姓的生活。由於轉基因食品所具有的潛在非安全性,為保護廣大消費者的權益,滿足其選擇和知情權以及出於國際貿易的需要,轉基因食品的檢驗越來越引起各國政府和有關食品監督機構的重視。目前,基於GMO特異DNA片段的定性PCR篩選方法已廣泛應用於GMO(Genetically Modified Organism)食品的檢測,一些國家將此作為本國有關食品法規的標準檢測方法。

一、轉基因食品的定性檢測

(一)PCR-ELISA法用於轉基因食品的定性檢測

PCR-ELISA是一種將PCR高效性與ELISA高特異性結合在一起的轉基因檢測方法。利用共價交聯在PCR管壁上的寡核苷酸作為固相引物,在Taq酶作用下,以目標核酸為模板進行擴增,產物一部分交聯在管壁上成為固相產物,一部分遊離於液體中成為液相產物。固相產物可用標記探針與之雜交,再用堿性磷酸酯酶標記的鏈親和素進行ELISA檢測,通過凝膠電泳對液相產物進行分析。該方法靈敏度高,可靠性強,易於操作,適於批量檢測,是適合推廣的一種快速轉基因檢測方法。

已有的研究報道,在應用PCR-ELISA法快速檢測轉基因食品的方法中,關鍵因素主要是以下幾個方麵。

1.固相引物的包被

固相引物的包被是指利用特殊試劑將5′磷酸化或氨基化的引物特異性地固定在附著物上,通常用處理過的PCR管壁充當附著物,目的是方便隨後的PCR擴增。一般認為,理想的固定是DNA分子的單一位點共價固定在附著物上,包被上的DNA分子可以通過同位素標記探針進行定量,通常有20~50ng的核酸分子可以吸附到管壁上並排成1~2nm長,高濃度的寡核苷酸並不能提高吸附量。包被的效果與溫度、時間、核酸分子的濃度以及緩衝液的種類和pH等有關。

2.PCR擴增

在包被寡核苷酸的管內進行PCR擴增,擴增條件因目的片段而異,對35S啟動子和Nos終止子,PCR反應體係一般為:10倍緩衝液5μL,25mmol/L Mg2+ 4μL,10mmol/LdNTPs 1μL,25μmol/L引物11μL,8μmol/L引物2(固相引物)1μL,Taq酶2U,加水至50μL。固相引物與液相引物的濃度比值決定了兩種產物的量,1∶1利於瓊脂糖凝膠電泳檢測,8∶1利於雜交檢測,同時也適合凝膠電泳分析。35S啟動子和Nos終止子的擴增條件一般為:94℃ 5min,54℃ 55s,72℃ 1min,1個循環;94℃ 30s,54℃ 50s,72℃ 30s,35個循環;72℃延伸8min。NPTⅡ的退火溫度為50℃。

3.ELISA檢測

變性後的固相產物在5倍SSC(含0.5%BR)中雜交1h,雜交後用0.5倍SSC,0.1%吐溫20洗掉非特異性結合的探針,加入100μLAP(1∶2500)使之與探針上的地高辛結合,10mg/mL的PNPP顯色30min後,通過酶標儀讀數(波長為405nm)。去掉空白對照,高於10為陽性,低於0.1為陰性。

PCR-ELISA法將PCR擴增的高效性和ELISA的高特異性結合在一起,靈敏度高達0.1%,足以達到歐盟的要求(轉基因檢測閾值為1%)。歐盟利用PCR技術對轉基因玉米和大豆的35S啟動子和Nos終止子進行水平測試時,檢測靈敏度達到2%,而對於含量為0.5%的105個陽性樣品則出現3個假陰性結果,並且許多電泳條帶模糊。而利用PCR-ELISA對轉基因大豆的檢測靈敏度比歐盟推薦PCR方法提高5~10倍。

(二)反轉錄PCR(RT-PCR)用於轉基因食品的定性檢測

最早報道RT-PCR的是Larrick(1992),他利用該法檢測外源基因在植物細胞內的表達情況。RT-PCR的原理是以植物總RNA或DNA為模板進行反轉錄,然後再經過PCR擴增,如果從細胞總RNA提取物中得到特異cDNA擴增帶,則表明外源基因得到了轉錄。該方法適用於通過檢測外源基因表達情況來檢測是否是轉基因食品。實驗可以以總RNA為材料,也可以以mRNA為材料,不同的材料在方法上不同,以下的具體操作供參考。