一、核酸探針標記物種類及其特點探針標記的目的是為了跟蹤探針的去向，確定探針是否與相應的基因組DNA雜交，即顯示出與核酸探針具有同源性序列的精確位置，從而判斷陽性菌落的位置、靶核酸在細胞中的位置(原位雜交)，或特異性片段的大小(轉移印跡雜交)等。
一種理想的探針標記物，應具備以下幾種特性：①高度靈敏性；②標記物與核酸探針分子的結合，應絕對不能影響其堿基配對特異性；③應不影響探針分子的主要理化特性，特別是雜交特異性和雜交穩定性，雜交體的解鏈溫度(tm)應無較大的改變；④當用酶促方法進行標記時，應對酶促活力(Km)無較大的影響，以保證標記反應的效率和標記產物的比活性，當標記探針還繼續作為下一步酶促反應的底物(如用於DNA序列測定)時，應不能影響此步驟的酶活性；⑤檢測方法除要求高度靈敏性外，還應具有高度特異性，盡量減低假陽性率。如果要求更嚴一些，它還應具有較高的化學穩定性，保存時間較長，標記及檢測方法簡單，對環境無汙染，對人體無損傷，價格低廉等。常用的探針標記物有兩類：放射性核素和非放射性核素標記物。
（一）放射性核素
放射性核素是目前應用較多的一類探針標記物，包括32P、3H和35S等，主要優點：①放射性核素的靈敏度極高，可以檢測到10-18~10-14g的物質，在最適條件下，可以測出樣品中少於1000個分子的核酸含量；②放射性核素與相應的元素具有完全相同的化學性質，因此對各種酶促反應無任何影響，也不會影響堿基配對的特異性、穩定性和雜交性質；③放射性核素的檢測具有極高的特異性，少數假陽性結果的出現，極少是由於放射性核素引起的，而主要是由雜交過程本身導致的。按嚴格規程操作(主要是預雜交和洗膜)則假陽性率極低。
其主要缺點：①易造成放射性汙染；②當標記活性極高時，放射線可以造成核酸分子結構的破壞；③多數放射性核素的半衰期都較短，因此必須隨用隨標，標記後立即使用，不能長期存放(3H與14C除外)。常用作探針標記物放射性核素有：
(1)32P32P放射性強，其所釋放的β-粒子能量高，穿透力較強，因此放射自顯影所需時間短，靈敏度高，被廣泛應用於各種濾膜雜交以及液相雜交中，特別適合於基因組中單拷貝基因的檢測。其缺點是半衰期短；射線散射嚴重，導致X線片上帶型輪廓不清，有時會影響到結果的分析，特別是當要求高分辨率時(如DNA序列測定和細胞原位雜交)。 32P大多是以標記的各種核苷酸(32P-NTP)和脫氧核糖核苷酸（32P-dNTP）的形式提供的。
(2)35S35S原子可以取代磷酸分子上的一個氧原子，從而形成35S標記的核苷酸分子。核苷酸分子結構上的這種改變，對於大多數核酸修飾酶(如DNA和RNA聚合酶、激酶和磷酸酶等)的活性沒有太大的影響，是其適宜的反應底物，可以直接替代32P標記的核苷酸用於探針標記。也有報道表明，這種結構上的改變會抑製DNA聚合酶的活性，使其摻入速率下降。
(3)3H3H釋放的β粒子能量極低，散射極少，因此在感光乳劑上的成影分辨率最高，本底較低，最適用於細胞原位雜交，但放射自顯影所需時間較長。目前也有較多的人用32P和35S代替3H進行原位雜交。3H的另一優點是半衰期長，標記的探針可存放較長時間。
(4)125I和131I碘放射性同位素在20世紀70年代曾被廣泛用於核酸探針的標記，現已極少被采用，但碘放射性同位素仍然有其特有的優點：①可以用化學方法直接進行標記，操作簡單，特別適合於RNA探針的標記；②放射線的散射作用較弱，分辨率較高，與3H差不多，而曝光時間則短得多，比較適合於細胞原位雜交；③來源方便，價格低廉。比較而言，125I較131I好，因為125I的半衰期較長、射線的能量較低。碘同位素最大的缺點是具有揮發性，雖然碘同位素一般是以不具有揮發性的碘化鈉形式提供的，但在反應過程中還是有可能產生揮發性碘，被人吸收後蓄積在甲狀腺中不易被排出，致使機體接受長期照射。
（二）非放射性標記物
非放射性指示係統是基於選用特異的互補探針相互作用來檢測各種生物靶分子。適宜的檢測係統是與這些探針配對的，直接通過共價結合，或間接地通過附加的特異高親和力的相互作用。新近發展起來的非放射性係統大多數是基於報告基因的酶學、生物化學或化學的結合。這些基團能被具有高靈敏光學的、發光的、熒光的或金屬沉澱的檢測係統檢測出來。
不同的非放射性係統可以分類為直接的和間接的兩種類型，它們之間的差別在於檢測反應的成分種類及其反應步驟的次數。直接係統大多是被用於檢測標準化的靶生物分子，而間接係統常常被用於檢測具有變異特性的不同靶生物分子。
用於直接係統的報告基團是直接地與探針結合，常使用的直接報告基團是熒光染料［如熒光素及堿性蕊香紅（Rhodamine）］和標誌酶如堿性磷酸酶（AP），或辣根過氧化物酶（HRP）與化學發光檢測結合。
在間接係統中，報告基團通過探針的修飾基團和被結合到修飾探針的特異指示劑分子之間非共價鍵的相互作用，間接地結合在一起。因此，間接係統首先要求用於特異分析的探針需預先導入特殊修飾基團。用作修飾基團的已知係統有維生素（如生物素）或各種半抗原，如地高辛、熒光素、二硝基苯基（DNP）、溴脫氧尿核苷或免疫金（Immunogold）。
在間接的非放射性係統中，最重要的係統是地高辛配基、生物素和熒光素係統。
1.地高辛配基係統
異羥基洋地黃毒苷配基，簡稱地高辛配基（Digoxigenin,DIG），是一種類固醇半抗原，自然界存在於洋地黃植物。dUTP是通過間臂連接類固醇半抗原地高辛配基（DIG-Dutp）。雜交反應後，雜交的靶DNA通過酶聯免疫法與一個抗體複合物［抗地高辛配基堿性磷酸酶複合物（AIG-AP）］結合，接著在5-溴-4-氯-3-吲哚酸鹽（X-磷酸鹽）和硝基藍四唑鹽（NBT）存在下，由酶催化生成顏色反應。
2.生物素係統