一、實驗目的
（1）了解細菌群體感應的檢測原理。（2）掌握細菌群體感應的檢測方法，為基於細菌群體感應抑製劑的篩選提供指導。
二、實驗原理群體感應
（quorumsensing）是指細菌向環境中分泌、釋放一些小分子量的化學信號分子促進細菌個體間的相互交流，協調群體行為從而調節微生物生理特性的機製。紫色色杆菌（Chromobacteriumviolaceum）紫色素的合成機製受細菌群體感應的調控。紫色色杆菌突變株CV026為ATCC31532的mini\|Tn5突變體，不能合成AI\|1信號分子（酰基高絲氨酸內酯類化合物，AHLs），因而不能產生紫色色素；當外源環境中存在較高濃度的AHLs，菌體會產生特征性的紫色色素，指征細菌群體感應調控的相關基因表達。AgrobacteriumtumefaciensA136（pCF218/pCF372）含有ptraI\|lacZ融合基因和traR基因，細胞自身不合成高絲氨酸內酯。當環境中存在信號分子時，TraR5與信號分子結合從而啟動啟動子的轉錄，進而使lacZ基因表達半乳糖酶，從而使培養基（加入有X\|gal）變藍色。Ⅱ類信號分子即自誘導物AI\|2（呋喃硼酸二酯類化合物），首先在哈氏弧菌（Vibrioharveyi）群體感應係統時發現。用於檢測AI\|2的指示菌是哈氏弧菌BB170，能特異性地檢測環境中的Ⅱ類信號分子並生物發光，通過檢測光強度方法可以方便地檢測出目標菌是否能產生Ⅱ類信號分子或者樣品中是否含有此類信號分子。哈氏弧菌BB152（autoinducer1－，autoinducer2+）為AI\|1缺陷型，可產生AI\|2，實驗中作為陽性對照。
三、實驗器材（1）菌種：紫色杆菌（Chromobacteriumviolaceum）CV026，根癌農杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）A136，哈氏弧菌（Vibrioharveyi）BB170，哈氏弧菌（Vibrioharveyi）BB152，待測樣品。（2）培養基：液體LB培養基、固體LB培養基、LM培養基、AB培養基。（3）抗生素：A136菌種培養用壯觀黴素（Sp）50μg/mL、四環素（Tc）45μg/mL。CV026菌種培養用卡那黴素（Km）20μg/mL。（4）儀器：恒溫培養箱、恒溫調速搖床、移液槍、pH計、電子天平、電熱鼓風幹燥箱、無菌操作台、電磁爐、－80℃冰箱、－20℃冰箱、台式高速冷凍離心機、微生物高通量篩選係統—熒光檢測儀、022微米濾膜、1mL一次性無菌注射。（5）其他：培養皿、三角瓶、打孔器。
四、實驗步驟（一）高絲氨酸內酯類信號分子（AI\|1）檢測1.平行劃線法(1)指示菌（CV026或A136）與待測菌過夜活化培養，培養基中加入相應的抗生素。(2)用接種環或牙簽（滅菌）分別挑取指示菌和待測菌在LB平板上平行劃線。(3)指示菌本身作陰性對照，分別用C6和C8的信號分子作陽性對照。(4)用A136為指示菌時固體LB中加入終濃度為50μg/mL的X\|gal。(5)將劃好的平板倒置於30℃的恒溫培養箱中過夜培養。示意圖如下：圖22\|1平板劃線檢測法
2.打孔法檢測法(1)培養液提取物的製備：待測菌過夜培養，離心獲得10mL上清液，用等體積的乙酸乙酯提取3次，有機相合並後，35℃旋轉蒸幹，再用適量的甲醇溶出（1～2mL），得粗提物。(2)報告平板製備：LB固體培養基加熱熔化，待冷卻至45℃左右加入10mL過夜培養的指示菌CV026或A136（加入終濃度為50μg/mL的X\|gal）混勻後立即倒平板。待凝固後，用直徑為6mm的打孔器（經滅菌處理）在平板上均勻打孔，在每孔中加入50μL上述提取液。30℃正置培養18h左右，觀察結果。示意圖如下：圖22\|2打孔檢測法