一、實驗目的（1）學習基因敲除在基因功能研究和酵母育種中的應用。（2）掌握Cre/loxP係統介導的基因敲除的原理及操作過程。
二、實驗原理基
因敲除技術在基因功能研究和微生物育種中發揮重要作用。該技術主要是將構建好的基因敲除序列組件轉化至細胞，由同源重組實現目標基因的敲除。其中的基因敲除序列組件是在抗性基因的兩側分別連接一段與目標基因兩側同源的短片段。同源重組的效率在很大程度上依賴於基因敲除組件的同源片段的長度，在酵母實驗中一般使用的同源序列為35～45bp。目前常用的基因敲除係統有Cre/loxP、Flip/FRT和TELEN等。Cre/loxP係統由來自E.coli噬菌體P的Cre重組酶和由2個13bp的反向重複序列和1個8bp的間隔區域構成的loxP位點兩部分組成（如圖26\|1）。Cre是1個38kDa的重組酶蛋白，它可以介導loxP的34bp重複序列的位點特異性重組，切除同向重複的2個loxP位點的DNA片段和1個loxP位點，保留1個loxP位點。Cre酶活性具有可誘導的特點，將Cre基因置於可誘導的啟動子控製下，通過誘導表達Cre重組酶而將loxP位點之間的基因切除，可實現特定基因在特定時間或者組織中的失活。因此Cre/loxP係統是進行基因組定點突變、研究基因精細結構的新途徑。圖26\|1loxP位點序列
三、實驗材料（一）菌種及質粒（1）菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BY4741，大腸杆菌DH5α。（2）質粒：pUG6、pSH65，其中pUG6質粒帶有Kanr抗性基因，兩端具有loxP位點，pSH65質粒帶有Zeocin篩選標記，在半乳糖誘導下表達Cre酶。（二）培養基（1）YPD培養基：酵母提取物1%，蛋白腖2%，葡萄糖2%，121℃滅菌20min，用於酵母菌的活化與培養。（2）麥芽汁培養基：麥芽和水以1∶4的比例混合，60℃水浴4h，8層紗布過濾，濾出液108℃滅菌20min，用於酵母菌發酵培養實驗。（三）主要工具酶和試劑ExTaqDNA聚合酶，rTaqDNA聚合酶，內切酶（HindⅢ、SalⅠ、BglⅡ），pMD18\|T載體試劑盒，膠回收試劑盒，G418、Zeocin和氨苄青黴素。其他試劑均為國產分析純試劑。（四）引物設計敲出組件的引物L1、L2是依據釀酒酵母ADH3基因和pUG6質粒中loxP\|Kan\|loxP設計的L1、L2的5′端分別有與酵母基因組ADH3基因起始密碼子（包括）前和終止密碼子（包括）後相同的45個堿基，用來進行同源重組。L1（L2）的3′端有19（22）個堿基與質粒pUG6中loxP\|Kan\|loxP兩側的上遊（下遊）某段序列相同，用來擴增loxP\|Kan\|loxP。引物A、B、C、D是依據酵母基因組ADH3基因設計的，用來驗證基因組中是否含有ADH3基因序列，A位於ADH3基因ORF的上遊5區域，B和C位於ORF上，D位於ADH3基因ORF的下遊3區域。引物KB和KC是依據敲除組件L1\|L2的loxP\|Kan\|loxP設計的，位於Kanr基因上，用於驗證敲除組件是否正確重組到原ADH3位置。這6條引物相互配對使用，用於敲除過程的驗證，引物對分別為：A\|B、C\|D、A\|D、A\|KB、KC\|D。表26\|1引物序列PrimerSequence（5′\|3′）L1tagaaaggaacactcgctttatctcttcgaccgaatttactatacCAGCTGAAGCTTCGTACGCL2tactggtactgcttcttgatttagtgattaatctttgctccactaGCATAGGCCACTAGTGGATCTGACATTCGCTCGTTACTACCTBAGCCCTTGACATTGGAACCTGCGATGGGTTACAGAGTDGCCTCTTACCTGCTTTGAKanBCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTKanCCGCAGACCGATACCAGG（五）儀器與設備PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像分析儀、冷凍離心機、恒溫培養箱、搖床、水浴鍋等。四、實驗步驟（一）釀酒酵母總DNA的提取取15mL新培養的酵母培養液，經離心收集酵母細胞，提取酵母總DNA，並瓊脂糖氧膠電泳驗證。（二）PCR獲得敲除組件L1\|L2以L1、L2為上下遊引物，pUG6為模板進行PCR擴增，獲得擴增產物L1\|L2。PCR標準擴增反應程序為：94℃熱啟動5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min共30個循環，最後72℃延伸10min。取3μLPCR擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳驗證。（三）乙醇沉澱擴增產物L1\|L2通過測序並比對，如果PCR方法獲得的敲除組件準確無誤，取200μLPCR擴增產物至無菌幹淨的15mL離心管中，加入25倍體積的冰冷無水乙醇。混勻，置－20℃冰箱中沉澱1h以上。10000rpm，4℃離心10min，去上清，用體積分數70%的乙醇洗2次，室溫下10000rpm離心3min。除去乙醇，晾幹，用50μL無菌ddH2O溶解沉澱的DNA，－20℃冰箱保藏，留做醋酸鋰法轉化時使用。（四）轉化采用醋酸鋰高效化學轉化法轉化敲除組件。（1）感受態細胞製備：用無菌接種環取凍存的酵母菌，在YPD平板上連續劃線接種，3d後在YPD平板上挑取單個菌落接種在10mLYPD培養基中搖菌過夜。把10mL菌液轉移到100mLYPD培養基中振蕩培養至A600為06。將菌液置於滅菌的離心管中離心，棄上清液。無菌水重新懸浮細胞，再離心收集菌體。於離心管中加入1×TE250μL，1×LiAC250μL，製成感受態細胞，需現做現用。（2）重組線性DNA片段轉化到酵母細胞：煮沸10mg/mL鮭魚精DNA5min，迅速置於冰上。取無菌15mLEP管依次加入線性化的DNA20μL，鮭魚精DNA10μL，感受態細胞200μL，用槍頭混勻後，依次加入10×TE60μL，10×LiAC60μL，50%PEG4000480μL，用槍頭混勻，30℃搖菌30min，加入70μL的DMSO，輕輕顛倒2～3次，置於冰42℃水浴鍋中熱休克15min，冰上放置2min，離心棄上清液，加入200μL1×TE懸浮，製成菌懸液。（五）篩選敲除菌株轉化後的酵母菌懸液塗布到含有200μg/mLG418的YPD平板上，28℃培養2～3d。通過影印平板法篩選轉化子，那些既能在不含任何抗生素的YPD上生長又能在含有G418的YPD平板上生長的菌落可能是正確重組的敲除組件L1\|L2的菌落。（六）PCR驗證轉化子挑取轉化子菌落，提取基因組DNA，分別用引物對A\|B、C\|D、A\|D、A\|KB、KC\|D和L1\|L2進行PCR驗證，將PCR擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳驗證。（七）去除抗性標記采用醋酸鋰法將質粒pSH65（帶有zeocin抗性標記）分別轉入不同菌株的陽性克隆子，YPG培養基培養過夜，使之在半乳糖的誘導下表達Cre酶切除陽性克隆子染色體上的G418篩選標記。培養物稀釋塗布於YPD平板，待菌落長出後，通過影印法將細胞轉移到兩份YPD平板中，一份含50μg/mLzeocin，一份含250μg/mLG418，30℃培養2～3d後觀察，zeocin平板上長出，但G418平板上不生長的菌落即為G418抗性標記已去除的轉化子。轉化子在YPD培養基中連續傳代培養直至丟失pSH65質粒，得到不含篩選標記的轉化子菌株。（八）乙醇脫氫酶的酶活檢測將驗證乙醇脫氫酶Ⅲ缺失的釀酒酵母菌株接種到麥芽汁培養基中，30℃，180r/min培養48h，離心收集菌體。用超聲破碎法獲得粗酶液，每隔15s測定340nm波長下NADH的吸光值。酶活定義：單位濕細胞在單位時間使吸光值每產生0001的改變定義為一個酶活。五、實驗結果記錄（1）瓊脂糖凝膠電泳PCR產物，求出DNA長度，判斷PCR產物是否是目標產物？（2）挑取的菌落中是否有假陽性克隆？六、思考題（1）基因敲除的方法有哪些？它們的原理分別是什麼？（2）在引物A1和A2的5′端分別設計41bp和40bp與釀酒酵母ADH3基因外側序列相同堿基的目的是什麼？