現代微生物學實驗指導-正文實驗二十九電泳蛋白組學分析菌種代謝差異

一、實驗目的學習和掌握蛋白質雙向電泳的基本原理和方法，運用雙向電泳-蛋白質組學方法評價高產與低產突變株的差異性。二、實驗原理高產與低產突變菌株的遺傳背景、代謝通路及代謝活性都表現出巨大差異。采用蛋白組學的方法，可以更直接與全麵評價突變株的代謝活性差異，從而幫助我們更深入地了解高產菌種的代謝特征，為菌種篩選提供指導。第一向步驟為等電聚焦（IEF），即根據蛋白質的等電點（pI）差異將蛋白質分離。第二項步驟為十二烷基硫酸鈉\|聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS\|PAGE），即利用蛋白質的分子量（Mr，相對分子量）差異將蛋白質分離。雙向凝膠電泳結果中的每個斑點都對應著樣本中的一種蛋白。因此，可將上千種不同的蛋白質分離開來，並得到每種蛋白質的等電點、表觀分子量和含量等信息。圖29\|1菌株差異蛋白表達分析路線圖

三、試驗材料與試劑配製

（一）試驗材料IPG幹膠條（ImmobilizedpHgradient，pH=4～7，線性），IPGBuffer（ImmobilizedpHgradientbuffer，pH=4～7），IPG覆蓋液（ImmobilizedpHgradientcoverfluid），二硫蘇糖醇（1，4\|Dithiothreitol，DTT），3\|［（3\|膽酰胺丙基）\|二乙胺］\|丙磺酸（CHAPS），四甲基乙二胺（N，N，N，N\|Tetramethylenediamine，TEMED），甲叉雙丙烯酞胺（N，N′\|methylenebisacrylamide），瓊脂糖（Argrose），丙烯酰胺（Acrylamide），十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecylSulfate，SDS），超純脲（UltraUrea），礦物油（MineralOil），甘油（Glycero），三羥甲基氨基甲烷（TrisAminomethane），碘乙酰胺（Iodoacetamide），過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP），甘氨酸（Glycine）等均購於Bio\|Rad公司（USA）；蛋白質定量試劑盒（內含ProteinAssayKitI，牛血清標準品ProteinStandardI，RCDCProteinAssayKitI），蛋白質清潔試劑盒（Clean\|upkit）購自Bio\|Rad公司（USA）；硫脲（Thiourea）、溴酚藍、考馬斯亮藍R\|250購自上海生物工程技術服務有限公司（Sangon）。冰醋酸、無水乙醇等試劑為通用的國產分析純。

（二）主要試劑的配製

（1）裂解液：8M尿素96g，2M硫脲304g，4%CHAPS08g，65mMDTT0196g，08％CarrierAmpholyte（pH3～10）400μl，加Milli\|Q水定容至20mL，分裝貯存於－20℃。（2）水化上樣緩衝液：8M尿素96g，2M硫脲304g，4%CHAPS08g，分裝貯存於－20℃，使用時加入65MMDTT0196g，08％CarrierAmpholyte（pH4～7）400μl，加Milli\|Q水定容至20mL，分裝貯存於－20℃中備用。（3）30%丙烯酰胺貯液：丙烯酰胺150g，甲叉基雙丙烯酰胺4g，加Milli\|Q水定容至500mL，045微米的濾膜過濾後，棕色瓶4℃冰箱保存。（4）平衡母液：50mMTris\|HCl（pH88）67mL，6M尿素7207g，20%甘油404mL，2%SDS40g，加Milli\|Q水定容至200mL；分裝貯存於－20℃備用；用之前加DTT或碘乙酰胺。（5）溴酚藍溶液：溴酚藍100mg，50mMTris\|HCl（pH68）60mg，加Milli\|Q水定容至10mL，分裝貯存於4℃備用。（6）濃縮膠緩衝液（05MTris\|HClpH68）：05MTris堿12g，用1MHCl調整pH至68，加Milli\|Q水定容至200mL，貯存於4℃備用。（7）4×分離膠緩衝液（Tris\|HClpH88）：15MTrisbase9075g，用1MHCl調整pH至88，加Milli\|Q水定容至500mL，貯存於4℃備用。（8）2×SDS凝膠上樣緩衝液：05MTris\|HCl（pH68）20mL，10%甘油20mL，10%SDS40mL，1%溴酚藍005mL，100mMDTT0154g（用時現加），加Milli\|Q水定容至10mL，貯存於4℃備用。（9）10×電泳緩衝液：25mMTris151g，192mM甘氨酸721g，01%SDS50g，加Milli\|Q水定容至500mL，棕色瓶常溫（25℃）保存，使用前稀釋成1×電泳緩衝液。（10）10%SDS：10gSDS溶於Milli\|Q水中，總體積100mL，混勻後室溫（25℃）保存。（11）10%AP：01gAP溶於Milli\|Q水中，總體積1mL，用時加水溶解。（12）瓊脂糖封頂液：05%低熔點瓊脂糖05g，25mMTris堿0303g，192mM甘氨酸144g，01%SDS1mL，0001%溴酚藍100μl，加Milli\|Q水定容至100mL，混勻後在微波爐中加熱直至瓊脂糖完全溶解，貯存於4℃備用。