一、實驗目的
（1）了解下一代測序技術的原理及其在微生物學研究中的應用。（2）掌握基因組裝軟件Velvet的使用方法。二、實驗原理第一代測序技術始於1975年Sanger的雙脫氧鏈終止法，發展到現在，Sanger測序用四種不同的熒光染料分別標記片段末端不同的堿基，通過電泳將不同長度的片段分開，根據末端堿基得到原始序列信息。目前，Sanger測序可以測到800~1000個堿基，但是測序通量很小，而且價格昂貴。2004—2005年間開始商業化使用的第二代測序技術（Next\|GenerationSequencing）克服了以上兩個缺點，它可以同時對多個DNA片段進行平行測序：將打碎後建庫的DNA片段錨定在固體介質表麵，比如通過連接接頭的方法將DNA片段錨定在多個磁珠上進行PCR反應（Roche/454平台），或者錨定在測序通道內表麵進行橋式PCR（Illumina平台）。通過對每個錨定DNA每加一個堿基進行一次“加上熒光染料—洗脫多餘染料—熒光成像掃描”的循環過程，實現平行高通量的深度測序（圖30\|1）。目前常用的平台是Roche/454公司的FLX測序儀Illumina的HiSeq2000測序儀和ABI的SOLiD測序平台。根據提供的DNA來源和前期處理的不同，二代測序技術可以用以解答不同研究目的的生物學問題，如可以用於微生物研究中的比較基因組學、轉錄組學、宏基因組學等。圖31\|1Illumina測序原理
本實驗將學習使用Velvet軟件組裝Illumina/Solexa平台基因組測序結果。Velvet軟件主要有兩個程序組成：velveth和velvetg。（1）velveth的輸入默認是fasta格式的序列文件，也能識別fastq、fasta.gz、fastq.gz、sam、bam、eland和gerald文件。序列類型默認是short，也可以是shortPaired、short2、shortPaired2、long或longPaired。命令格式為：$./velvethoutput_directoryhash_length［［\|file_format］［\|read_type］filename］velveth運行的結果生成一個hash表，並輸出3個文件，其中Roadmaps和Sequences文件是下一步velvetg程序運行必需的。Log：日誌文件Roadmaps：路線圖文件Sequences：序列文件，包含所有輸入的序列（2）velvetg是velvet的核心程序，其命令格式為：$./velvetgoutput_directory/［\|cov_cutoff］［\|max_coverage］…運行的結果輸出以下文件：contigs.fa：fasta格式的組裝好的片段，長度大於2k（k為velveth運行時用的字長）PreGraph：中間組裝圖LastGraph：最後組裝圖Graph：最後組裝圖stats.txt：統計信息三、實驗材料與儀器（1）計算機（安裝有UbuntuLinux係統）。（2）E.coli基因組測序原始序列文件，E.coliK12的基因組測序數據可以從下麵網址下載：http：//download.clcbio.com/testdata/raw_data/solexa.zip。四、實驗步驟（1）分離細菌E.coli單克隆，菌株在25mLLB中培養過夜，用於基因組DNA提取。（2）基因組提取可以用細菌基因組提取試劑盒，如QIAGENDNeasyBlood&TissueKit，DNA提取步驟參考試劑盒說明手冊。（3）紫外光譜檢測提取的基因組DNA質量。一般基因組DNA樣品（～20μg）在230nm與260nm有吸收峰，要求比值280/260>18；並且比值260/230>2。（4）每菌株樣品提交至少2μg基因組DNA用於高通量測序。目前測序公司常見用Illumina公司的HiSeq2000測序儀，可測兩末端各100bp的數據。測序文庫的構建流程及其他Illumina平台測序技術可以參考Illumina公司網站的說明：http：//www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn。（5）測序數據的預處理。高通量測序的序列數據一般存儲在FASTQ格式文件，文件後綴一般為.fastq，.fq等。FASTQ格式以每個測序讀長（read）為4行，分別為頭、序列、序列ID（可選）和質量分數（ASCII編碼表示）。@HWI-EAS737∶1∶1∶2∶687#0/1TGTCTANTGAATTCTAAAAACAGTACTTTTNTTGTTTNTTTGCAAAAAAA