（2）試劑和器材
試劑：① 鹽析提取的人γ球蛋白；
② 0.5mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、2mol/L NaCl、10%疊氮化鈉；
③ DEAE-Sephadex A-50（下稱A-50）、PEG；
④ 0.1mol/L，pH7.4 PBS(配製見鹽析部分)；
器材：① 層析玻璃柱［1.3cm（內徑）×40cm（長度）］、滴定鐵架、自由夾、螺旋夾、尼龍紗(200目)；
② 普通冰箱、751型紫外分光光度計、電導儀、抽濾裝置(包括抽氣機、幹燥瓶、布氏漏鬥、橡皮墊圈、抽濾瓶)、pH計；
③ 透析袋、坐標紙、濾紙、pH精密試紙；
④ 量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。
（3）操作步驟
① A-50預處理：稱A-50 5g，懸於500mL蒸餾水內，1h後傾去上層細粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15mL的比例，將A-50浸泡於0.5mol/L NaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏鬥（墊有2層濾紙）中抽濾，並反複用蒸餾水抽洗至pH呈中性；再用0.5mol/L HCl以相同操作過程處理，最後以0.5mol/L NaOH再處理一次。處理完後，將A-50浸泡於0.1mol/L pH7.4 PBS中過夜。
② 裝柱、平衡、加樣、洗脫和收集:詳見第六章。
③ 測蛋白質：分別測定每管OD280，與OD260,按公式計算各管蛋白質含量。並以OD280為縱坐標，以試管編號為橫坐標，繪製洗脫曲線。
④ IgG的純度鑒定可采用下列方法之一鑒定：
區帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳後，隻在γ-球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度硫酸銨鹽析樣品進行電泳，以資比較。
瓊脂雙相雙擴散鑒定：預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉澱線。
免疫電泳鑒定：孔內加待測樣品，電泳後，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則隻出現一條弧形的沉澱線，且沉澱線位於γ-球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則隻有一條區帶。
（4）注意事項
① 柱的選擇：從理論上說，隻要柱足夠長，就能獲得理想的分辨率，但由於層析柱流速同壓力梯度有關，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
② 純化過程必須嚴格控製緩衝液的pH及離子強度。樣品與A-50必須用洗脫緩衝液徹底平衡後，才能進行柱層析。
③ 所裝的柱床必須表麵平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。
④ 洗脫過程中應嚴格控製流速，切勿過快。
⑤ 上樣的體積要小，濃度不宜過高。
⑥ 加樣及整個洗脫過程中，嚴防柱麵變幹。
2.SPA-Sepharose CL-4B親和層析法
（1）原理葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A，SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁中分離的蛋白質，具有與多種哺乳動物IgG分子Fc段結合的能力，並與不同IgG亞類的結合力有所差別。改變pH及離子強度可洗脫結合於SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。