6.影響複性效率的因素
影響複性效率的因素有很多，主要包括：
① 蛋白質的複性濃度：正確折疊的蛋白質的得率低通常是由於多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質的濃度是使蛋白質聚集的主要因素，因而，一般濃度控製在0.1～1mg/mL；如果變性蛋白質加入複性液中過快，容易形成絮狀沉澱，可能是蛋白質重新凝聚的緣故。所以我們采用在水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白質，使變性蛋白質在複性液中始終處於低濃度狀態。
② pH和溫度：複性緩衝液的pH必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質子化作用，影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低複性效率，最適宜的複性pH一般是8.0～9.0。
此外，影響複性效率的因素還有變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
（三）重組蛋白包涵體純化
重組蛋白包涵體的純化步驟總體包括溶解、複性、色譜等手段，並以SDS-PAGE、蛋白質印跡等進行檢測鑒定。這裏以大腸杆菌中表達重組麥芽糖結合蛋白MBP-Rep為例，闡述對形成的包涵體進行分離純化，包括分離、溶解、複性、離子交換、多糖樹脂親和層析。
1.純化過程
（1）MBP-Rep融合蛋白溶解性分析收集誘導細胞，溶於1mL，50mmol/L Tris緩衝液，pH分別取8.5、8.0和7.4，其中含100mmol/L NaCl。經超聲破碎（300W，總時間2min，脈衝振蕩，開5s停5s），溶菌液冰浴30min後，4℃下15000r/min，離心20min，所得上清液、沉澱分別收集。沉澱以1mL相應Tris緩衝液溶解，等量的沉澱溶液與上清液分別走10%SDS-PAGE。
（2）包涵體準備、提取從1L發酵液中收集誘導細胞，細胞以0.85%鹽溶液洗滌2次。將細胞以10mL/mg溶於Tris緩衝液(50mmol/L，pH8.5)，超聲振蕩（300W,每間隔9s振蕩9s，5min）。於4℃,8000r/min離心20min。以TTN緩衝液(pH8.5，50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、2%曲拉通X-100)洗滌2次，以TN緩衝液(pH8.5，50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl)洗滌1次。
（3）溶解、複性加Tris-Urea緩衝液(pH8.5，50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、4mol/L尿素)，37℃下靜置5h。20℃、15000r/min離心20min，去沉澱，取上清溶液，4℃下加入其10倍體積的複性緩衝液[pH8.5，50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、10%(體積分數)甘油、0.2%聚氧乙烯月桂醚(C12E9)、Sigma]，緩衝液以5mL/h速度加入並緩慢攪拌，攪拌過夜，然後超濾濃縮(Amicon，Millipore)。
（4）IEC10mL柱填充3mL陰離子交換劑(Q-Sepharose;Sigma-Aldrich Corp.)，以平衡緩衝液(pH8.5，50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、10%甘油和0.2%C12E9)平衡，蛋白液以流速15mL/h上樣，再用上述複性緩衝液洗滌，然後以不含去垢劑C12E9的相同緩衝液洗滌，最後以NaCl梯度洗脫（50mmol/L～1mol/L，間隔25mmol/L），不含去垢劑。
（5）多糖樹脂親和色譜（MBP對多糖的親和作用）20mL柱裝3mL多糖樹脂，以平衡緩衝液(pH8.5，25mmol/L Tris-HCl、325mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、10%甘油)平衡，將混合的MBP-Rep部分（雜蛋白帶最少的）上樣，以複性緩衝液洗滌（5倍床層體積），然後分別用含200mmol/L、100mmol/L NaCl的緩衝液洗滌。最後用含麥芽糖的洗脫緩衝液(pH8.5，25mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF、10%甘油、10mmol/L麥芽糖)洗脫。
（6）MBP-Rep融合蛋白分析活性分析實驗：26-nt寡核苷酸(5′-GCTATAATATT*ACCTGAGTGCCCCGC-3′)構成Rep蛋白識別位點(*)，可與Rep共價結合。二者在22℃下，反應緩衝液(pH7.6，25mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl、5mmol/L MnCl2、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中反應30min。然後加入2×SDS-PAGE樣品緩衝液（10μL），94℃下保溫5min。再進行12%SDS-PAGE電泳（50V×15h），以MilliQ水洗3次，加固定液(40%甲醇、10%乙酸)，過夜。MilliQ水衝洗3次，用考馬斯亮藍染色3～5h。
對照實驗：以不含上述識別序列位點、但等長的寡核苷酸代替。
2.實驗結果與分析
MBP是作為分子伴侶，能提高蛋白質溶解性，幫助折疊，保護重組蛋白Rep免受蛋白酶降解，增強蛋白質穩定性，能減少包涵體形成。據報道成熟MBP蛋白分子質量為40ku，預測目的蛋白MYMIV-Sb[MP]Rep大小為41.2ku，因此融合蛋白MBP-Rep應該是81.2ku，這與IPTG誘導表達結果一致。
經誘導表達的細胞總蛋白質中含有很明顯的分子質量約80ku的重組蛋白，而對照細胞則沒有，另外從其他條帶比較，誘導細胞與對照細胞的蛋白質基本一致，隻是條帶比較淡些，推測是重組蛋白高表達影響到細胞自身正常代謝。
即使在MBP存在下，重組蛋白還是有相當部分形成包涵體，因此對包涵體的提取、複性、分離、純化是必要的。比較pH分別在8.5、8.0、7.4下的溶解性，差別不大，選用pH8.5，在後續分離純化過程所選用的緩衝液也都設定pH8.5。複性、純化效果，可以看出經洗滌後的包涵體蛋白質與細胞總蛋白質有所差別，經折疊複性後蛋白質得到一定純化，經離子交換後的蛋白質主要有3條帶，經親和色譜後蛋白質隻剩80ku一條。
對複性純化後蛋白質的活性鑒定表明，該蛋白能識別含有(5′-GCTATAATATT*ACCTGAGT GCCCCGC-3′)特異序列的寡核苷酸,看出多出了一條分子質量較大的帶，即MBP-Rep-DNA複合物，證明重組蛋白經正確折疊，有生物活性。
另外，以蛋白質印跡分析表明，不論是單獨的融合蛋白MBP-Rep，還是MBP-Rep-DNA複合物，都能Rep對應的抗血清產生免疫反應，顯示出來，也同時證明其有效折疊。