選用一種與待測蛋白質的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質作為標準蛋白質，配製成濃度為1.0mg/mL的溶液。常用的標準蛋白質為牛血清白蛋白（BSA）。
由於不同蛋白質中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環境也不同，不同蛋白質溶液在280nm的吸光度也有不同；另外，由於蛋白質的紫外吸收峰常因pH的改變而有變化，用紫外吸收法時，要注意溶液的pH（最好與標準曲線製定時的pH一致）。所以此法不是嚴格的定量方法，適用於粗提蛋白質的測定。許多在紫外區引起光吸收的物質會幹擾測定，若存在非蛋白質類的發色基團（如血紅素、吡哆醛）則A280會增大。在280nm下核酸的消光大約是蛋白質的10倍，有強幹擾作用。
測定時根據需要，對待測蛋白質溶液用合適的緩衝液（無紫外吸收）稀釋，確保測量精度。用空白對照和石英比色皿在紫外分光度計上直接讀取待測蛋白質溶液在280nm的吸光度，控製蛋白質濃度在0.1～1.0mg/mL，檢測的靈敏度為0.2～2.0mg/mL，比色皿的最小測量體積為0.1mL。
（二）280nm和260nm的吸收差法
核酸對紫外光有很強的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質強10倍（每克），但核酸在260nm處的吸收更強，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的吸光度是280nm處的2倍，而蛋白質則相反，280nm紫外吸收值大於260nm的吸收值。通常情況下，純蛋白質的吸光度比值：A280/A260≈1.8，純核酸的吸光度比值：A280/A260≈0.5。
含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下麵的經驗公式，即可算出蛋白質的濃度：
蛋白質濃度
此經驗公式是通過一係列已知不同濃度比例的蛋白質（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數據來建立的。
采用相似的吸光度差異的原理，還可采用下麵的公式來測定含有核酸的蛋白質樣品：
蛋白質濃度
蛋白質濃度
此外，也可先計算出A280/A260的比值後，從中查出校正因子“F”值，同時可查出樣品中混雜的核酸的百分含量，將“F”值代入，再由下述經驗公式直接計算出該溶液的蛋白質濃度。
（三）215nm與225nm的吸收差法
低濃度的蛋白質會由於比色皿的吸收，而從溶液中損失。采用高離子強度，或在含有非離子表麵活性劑的緩衝液中測定，有助於防止這種損失。
通常不用280nm的光吸收測定蛋白質的稀溶液濃度，而是利用215nm與225nm吸收值之差，通過標準曲線來測定。用已知濃度的標準蛋白質，配製成20～100mg/mL的一係列差5.0mL的蛋白質溶液，分別測定215nm和225nm的吸光度，並計算出吸收差：吸收差D=A215-A225。以吸收差D為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。在特定條件下，可以精確測定蛋白濃度為5μg／L的溶液。
本方法在蛋白質濃度20～100mg/mL範圍內，蛋白質濃度與吸光度成正比，當pH在4～8，蛋白質在215nm～225nm的吸光度與pH無關。NaCl、(NH4)2SO4以及0.1mol/L磷酸、硼酸和Tris等緩衝液，都無顯著幹擾作用，但是0.1mol/L NaOH、0.1mol/L乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸、巴比妥酸等緩衝液的215nm光吸收值較大，必須將其濃度降到0.005mol/L以下才無顯著影響。采用此法必須謹慎，以防幹擾。用如下經驗公式：
稀溶液蛋白質濃度
（四）238nm的光吸收法（肽鍵測定法）
肽鍵在遠紫外區有強吸收，最大吸收峰λmax在190nm，但由於氧的吸收和分光光度計的輸出困難，一般選用238nm測定。蛋白質溶液在238nm處的光吸收強弱與肽鍵的含量成正比。用標準蛋白質溶液配製係列濃度（50～500μg／mL）的蛋白質溶液5.0mL，測定光吸收值A238，以A238為縱坐標，蛋白質含量為橫坐標，繪製標準曲線。常用0.9%NaCl溶液適當稀釋蛋白質溶液進行測定，再由標準曲線求得未知樣品的濃度。
這種測定方法簡單、靈敏，樣品可回收，對於不同蛋白質的光吸收變化很小。蛋白質溶液進行柱色譜分離時，用238nm檢測洗脫液的蛋白質峰位，比280nm吸收法靈敏。但是測定時需要在遠紫外區校正分光光度計的精度，許多緩衝液和多種有機化合物，如醇、酮、醛、醚、有機酸、酰胺類和過氧化物、血紅素等都有幹擾作用。最好用無機鹽、無機堿和水溶液進行測定。含有有機溶劑的樣品，經蒸幹或其他方法去除幹擾物質後，用水、稀酸或稀堿溶解後測定。
三、雙縮脲法
雙縮脲（NH2—CO—NH—CO—NH2）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。因為蛋白質中有多個肽鍵，也能與Cu2+發生雙縮脲反應，且紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質含量的關係在一定範圍內符合比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子質量無關，所以可用雙縮脲法測定蛋白質的含量。雙縮脲法常用於0.5～10mg／mL蛋白質溶液的測定，能測出的蛋白質含量需在約0.5mg以上。
幹擾這一測定的物質主要有：硫醇、某些氨基酸以及具有肽性質的緩衝液，如Tris緩衝液等，因為它們產生陽性呈色反應，Cu2+也容易被還原，有時出現紅色沉澱，蔗糖、甘油也幹擾測定。可用沉澱法除去幹擾物，即用等體積10%冷的三氯乙酸沉澱蛋白質，然後棄去上清液，再用已知體積的1mol／L NaOH溶解蛋白質。
此法的優點是使用試劑價廉易得，操作簡便，較快速；反應主要涉及肽鍵，受蛋白質特異性影響較小，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近；以及幹擾測定的物質少。主要的缺點是靈敏度差，所需樣品量大。
因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。因為核酸等其他非蛋白質成分不幹擾顯色，這對早期提純階段的測定非常有用。在複雜生物體係中需要快速測定其中蛋白質的含量時，最常用此法。
四、Folin-酚試劑法（Lowry法）
Folin-酚試劑法的顯色原理與雙縮脲方法是基本相同，隻是加入了第二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。反應過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成蛋白質-Cu2+複合物；第二步：蛋白質-Cu2+複合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。該呈色反應在30min內即接近極限，並且在一定濃度範圍內，藍色的深淺度與蛋白質濃度呈線性關係，故可用比色的方法確定蛋白質的含量。
此法可檢測的最低蛋白濃度達5μg/mL，通常測定範圍是20～250μg/mL。此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。
此法是在雙縮脲法的基礎上引入Folin-酚試劑，對雙縮脲反應發生幹擾的離子，同樣容易幹擾Lowry反應，而且對後者的影響還要大得多。幹擾雙縮脲反應的基團，如—CO—NH2，—CH2—NH2，—CS—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH—CHNH2，—CH2OH，—CHOH—CH2—NH2以及在性質上是氨基酸或肽的緩衝劑，如Tris緩衝劑以及糖類、硫酸銨、巰基化物均可幹擾Folin-酚反應。此外，所測的蛋白質樣品中，若含有酚類、檸檬酸，均對此反應有幹擾作用。濃度較低的尿素（0.5%）、胍（0.5%）、硫酸鈉（1%）、硝酸鈉（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質在所測樣品中含量較高時，必須作校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，隻需增加Na2CO3-NaOH濃度，即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高Na2CO3-NaOH的濃度1～2倍，這樣即可糾正顯色後色淺的弊病。
此法的優點是操作簡單，不需特殊儀器設備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10～20倍，較雙縮脲法靈敏100倍。缺點是費時間較長，要精確控製操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，幹擾物質較多。
Folin-酚試劑法，是目前蛋白質定量測定中最靈敏和應用最廣泛的方法之一。
（一）材料、儀器
1.Fo1in-酚試劑
Fo1in-酚試劑甲：將4% Na2CO3溶液與0.2mol/L NaOH溶液等體積配製Na2CO3-NaOH溶液；1%CuSO4溶液、2%酒石酸鉀鈉溶液等體積配合成硫酸銅-酒石酸鉀鈉溶液。然後將這兩種試劑按50∶1的比例配合，即成Folin-酚試劑甲。此試劑臨用前配製，一天內有效。