按照南部和紐約的紳士們所遵守的“社交禮法”來說，這種言詞等於要求進行決鬥。對手的挑戰書很快便送來了。漢密爾頓原本沒有必要接受挑戰，他無須證明自己的勇敢，他有一個妻子和一大家人靠他養活。而且，漢密爾頓認為，在決鬥中擊斃對手無異於謀殺。可是他必須維護自己的尊嚴，他的心胸高尚這一弱點，迫使他接受來自伯爾的挑戰。
漢密爾頓預感自己的死對家人來說將是一場災難，他給妻子寫了三封信，稱她是“世界上最好的妻子，最好的女人”。漢密爾頓決定要證明自己勇敢，而又不使對方喪命：保留發射第一槍的權利，然後放棄他，希望伯爾開槍失誤，從而得到榮譽上的滿足。但是，伯爾卻無意於不求命中。
1804年7月11日那個明媚的夏日清晨6時，漢密爾頓和他的助手渡過哈得遜河，來到河邊斷崖下一處樹叢中，副總統伯爾和他的朋友正在那裏開辟決鬥場地。雙方的距離經商定為相隔10步。當“舉槍”
的信號發出後，伯爾抬起手臂，細心瞄準，隨即扣動扳機，漢密爾頓胸腔下部被子彈射中。他應聲倒下時，手指痙攣地動彈了一下，漫無目標地開了一槍。漢密爾頓經曆了30小時劇烈的痛苦後，才溘然長逝。
艾倫·伯爾事後逃到了華盛頓，傑斐遜總統和顏悅色地接待了他，並將路易斯安那領地最好的職位授予他。這並非傑斐遜要獎賞殺害漢密爾頓的凶手，而是這時總統還有用得著伯爾之處。因為伯爾身為副總統，必須充當國會參議院的議長，該院當時作為彈劾法庭正在舉行會議，審訊最高法院法官蔡斯。因為他被眾議院共和黨議員指控，有濫用職權和其他若幹不法行為。
在伯爾主持的會議上，約翰·倫道夫代表眾議院進行起訴，盧瑟·馬丁和羅伯特·哈珀兩位著名律師作了辯護。雖然蔡斯任法官時態度粗暴，但對他提出的那些嚴重的指控卻沒有真憑實據。到了1805年3月初表決時，有相當多的共和黨參議員同聯邦黨人聯合一致，開脫了這位犯有“罪行和過失”的法官。這次審訊表明，傑斐遜打算清理保守的聯邦黨人的計劃沒有成功，正如他本人所言：“在選舉中遭到失敗的聯邦黨人退據司法機構，他們盼望能從那道防柵發炮，轟垮共和黨人的一切堡壘。
在傑斐遜第一屆任期內，經濟繁榮，版圖擴大，國家安定，這為他競選連任鋪平了道路。1804年2月，在民主共和黨的黨團會議上，人們一致同意他競選連任。現任副總統因為行為不端，已被大家唾棄，大家一致同意把伯爾從黨的候選人名單上一筆勾銷，而來自紐約州的喬治·克林頓獲得副總統候選人的提名。聯邦黨的總統和副總統候選人，分別為查爾斯·平克尼和魯弗斯·金。1804年的競選活動遠不如4年前的那次緊張、激烈，因為人人都清楚，傑斐遜之當選已是鐵板釘釘的事。
果然，傑斐遜大獲全勝，以162票對14票的壓倒多數擊敗了聯邦黨的候選人查爾斯·平克尼。
傑斐遜的第二任期是在一片喜氣洋洋的氛圍中開始的，但是不久就遇到了麻煩，最後在困難中黯然結束。
傑斐遜本想繼續推行自己“賢明而節儉”的政策，不料他的政黨卻開始按選區分裂為許多派別：力圖擴張領土的西部人，新英格蘭的受壓抑者，弗吉尼亞刻板的民主共和黨人，中部各州對官職大小斤斤計較的民主主義者。從國際環境看，拿破侖稱雄歐洲大陸，不列顛則控製了海洋。雙方極力推行大陸封鎖或海上封鎖的政策，欲置對手於死地。對美國而言，這是一種比1792年到1801年期間各次戰爭更加難以應付的局麵。
對傑斐遜的時運起決定作用的這一年，是以伯爾陰謀案這一插曲告終的。伯爾在副總統任期屆滿之前，曾私下同英國駐美公使梅裏接觸，提議如皇家海軍予以合作，則願取得50萬美元，使路易斯安那從聯邦分離出去。公使認為此事可行，便力促英國政府付款，隻是當時唐寧街的權貴正忙於對法國的戰爭，無意推動路易斯安那的分離運動。
但是，伯爾並未死心。他帶著幾個追隨者到了西部地區，與那裏的一些冒險分子密謀策劃。他首先是要促成路易斯安那領地分離，並在該地自任總統；然後再進入得克薩斯並“解放”西班牙統治下的墨西哥。
1806年夏，伯爾在肯塔基的列克星敦成立總部，積極招募人員來從事他的冒險活動。不料，有人給傑斐遜總統寫了一封揭發信，說西部有“一樁隱蔽、黑暗、邪惡而流布廣遠的陰謀。”總統遂發布文告，下令緝拿伯爾。
伯爾被緝拿歸案後，以叛國罪受審。但是，主持審訊的最高法院的首席法官約翰·馬歇爾極力主張，應當嚴格遵守憲法對叛國罪所下的定義，即“與合眾國作戰，依附……合眾國之敵之者，”以及憲法所規定的“經該案兩人證明”這一條款。馬歇爾的結論是：僅僅招募人員意圖謀反並非叛國。伯爾由此獲得開釋。傑斐遜對這一判決深為不滿，但又無可奈何。
1807年，英國海軍以武力強征美國水手服役的行動造成了新的戰爭威脅。為了維護美國在英法戰爭中保持中立的既定國策，傑斐遜說服國會通過了禁運法案，禁止將美國商品運往其他任何國家，禁止美國船隻駛往外國港口。這一法案，用傑斐遜的話來說，就是“除了戰爭以外，這是我們所能要出的最後一張牌了。”這項法案遭到了新英格蘭地區商人們的激烈反對，後來國會通過了一項撤銷禁運的法令，1809年3月1日傑斐遜予以簽署。3天後，他任期結束，告老還鄉，回到弗吉尼亞的蒙蒂塞洛，如喬治·華盛頓那樣，從此過起了隱居的生活。