梭菌特異性引物的設計及其在解析窖泥中梭菌多樣性的應用 胡曉龍 王海燕 吳群 徐岩*
食品科學與技術國家重點實驗室，教育部工業生物技術重點實驗室，生物工程學院，
食品安全和營養的協同創新中心，江南大學，蠡湖大道1800號，江蘇無錫 214122
摘要：本研究根據細菌16S rRNA數據庫，成功設計一對能特異擴增梭菌的引物SJ-F / SJ-R，並通過理論及實驗驗證其特異性。引物對SJ-F / SJ-R能擴增梭菌綱中19個科及未分類梭菌，但對每個科梭菌擴增覆蓋率有所差異。利用暗發酵體係窖泥再次驗證該引物對的特異性及通用性，結果表明利用該引物所檢測到的13種細菌分別屬於7個屬中的12種梭菌。該引物對與常見細菌通用引物P2 / P3相比，多檢測到5個屬於梭菌綱的屬(Roseburia，Tissierella,Sporanaerobacter,Alkalibacter和Halothermothrix)。因此，本研究為將來解析厭氧環境或暗發酵體係中梭菌群落結構及研究其在上述體係中的群落動力學提供了一個快速及有效方法。
關鍵詞：梭菌特異引物；PCR-DGGE；生物多樣性；窖泥；複雜微生物體係
Development，validation and application of specific
primers for analyzing the clostridial diversity in dark
fermentation pit mud by PCRDGGE
HU Xiao-long，WANG Hai-yan，WU Qun，XU Yan*
State Key Laboratory of Food Science and Technology，The Key Laboratory of Industrial
Biotechnology，Ministry of Education,School of Biotechnology，Synergetic Innovation
Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，1800 Lihu Avenue,
Wuxi，Jiang Su，214122，China
Abstract:In this study，a Clostridiaspecific primer set SJF and SJR，based on the available 16S rRNA genes sequences from database，was successfully designed and authenticated by theoretical and experimental evaluations.It targeted 19 clostridial families and unclassified_Clostridia with different coverage rates.The specificity and universality of novel primer set was tested again using the dark fermentation pit mud(FPM).It was demonstrated that a total of 13 closest relatives including 12 species were affiliated with 7 clostridial genera，respectively.Compared to the wellaccepted bacterial universal primer pairP2/P3，five unexpected clostridial genera including Roseburia，Tissierella,Sporanaerobacter,Alkalibacter and Halothermothrix present in the FPM were also revealed.Therefore，this study could provide a good alternative to investigate the clostridial diversity and monitor their population dynamics rapidly and efficiently in various anaerobic environments and dark fermentation systems in future.
Key Words:Clostridiaspecific primers;PCRDGGE;Biodiversity;Dark fermentation pit mud;Complex microbial ecosystem
1前言
梭菌綱微生物是一類專性厭氧且能產芽孢的細菌，包括許多目、科、屬及種，主要棲息於多種厭氧環境體係中。該類微生物具有多重功能，這主要是由於其利用底物的多樣性及產物的廣譜性［1］。首先，梭菌作為有前景的微生物資源及重要的環境調節者的功能主要體現在：①在多種暗發酵體係中產生多種不同碳鏈長度的脂肪酸、能源氫氣及生物燃料等［2-4］，這些環境友好型能源可以替代環境汙染嚴重的化石燃料；②利用低級生物質及可再生原料［5］，這也與全球提倡的可持續發展理念一致；③降解複雜的碳水化合物、有機化學物質及還原含硫元素化合物［1，6，7］，在許多環境中的微生態平衡中起著至關重要作用。其次，也有某些梭菌作為酸敗及產氣的主要細菌一旦大量出現在肉奶製品中［8，9］，這將造成了肉奶製品的變質。因此，很有必要建立一種能快速檢測梭菌綱細菌的方法，這也有助於深入認識許多環境體係中(自然環境、暗發酵體係及肉奶製品等)梭菌的多樣性，尤其是以梭菌群體為基礎的暗發酵體係，通過該方法可以監控其中梭菌的群落結構動態變化及篩選其中功能梭菌，進而結合原位強化技術提高暗發酵體係的發酵性能。
但是，如何快速檢測多種環境中梭菌多樣性及其群落動態變化一直是一個挑戰。利用傳統的可培養方法係統及全麵研究梭菌多樣性幾乎不可能，這主要是因為目前沒有一種能僅供所有梭菌同時生長的限製性培養基，另外自然界中的細菌絕大多數是在現有條件下不可培養的。此外，梭菌屬於專性厭氧細菌，其對氧氣敏感度非常高，這也要求梭菌篩選及培養時必須在嚴格無氧的條件下進行；同時傳統的可培養方法的勞動強度大及耗時長［10］。近年來，研究微生物多樣性的分子手段(DGGE/TGGE、SSCP、T-RFLP、ARDRA、RAPD及焦磷酸測序技術等)越來越受許多微生物學家的青睞並廣泛應用［11］。這些方法克服了應用傳統培養方法解析微生物多樣性存在的困難，但這些方法都需要有合適的引物去解析相應的微生物群落。其中DGGE作為一種經典的分子生態學技術廣泛應用於監控微生物群體變化規律及比較相似樣品之間微生物群落結構。利用DGGE技術，許多學者對不同窖齡及位置的窖泥樣品的微生物群落結構進行解析［12，13］，其中檢測到很多用傳統可培養方法尚無發現的微生物。目前，研究窖泥細菌多樣性的引物多為細菌通用引物P2/P3，檢測結果表明梭菌在窖泥中豐度最高但主要為未培養得到的梭菌，這為了解窖泥重要功能、微生物梭菌在窖泥中的潛在作用帶來難度。由於細菌通用引物沒有選擇性，所以當一些重要梭菌的含量少於1%時不能被檢測出來［14］。另外一方麵，也有一些文獻報道了關於梭菌特異性引物設計及應用，但這些引物的擴增特異性僅限於梭菌綱中的一個或兩個簇［15，16］。因此，這些梭菌引物不能同時更全麵地檢測環境中的梭菌綱細菌群體，使得一些具有重要功能其他簇梭菌漏掉。綜上所述，設計關於梭菌綱細菌的特異性及通用性引物非常有必要，進而更係統地認識環境中梭菌多樣性及其在相應環境中的潛在功能。
本研究旨在建立一種能用於多種厭氧環境中快速且檢測更多梭菌多樣性的分子生態技術。其中關鍵步驟是設計一對特異性及通用性的梭菌引物，並用理論及試驗驗證其有效性，最後將該方法應用於複雜微生物體係窖泥再次驗證該引物對的特異性及通用性。
2材料與方法
2.1菌種培養條件及其基因組提取
本研究中所用梭菌及非梭菌菌株，這些菌株幾乎均從白酒的釀造環境窖泥(FPM)、酒醅(Zaopei)及大曲(Daqu)中篩選分離得到。梭菌培養於梭菌增強培養基、37℃及厭氧條件；乳酸菌培養於MRS培養基(Oxoid CM0361)、37℃及厭氧條件；其餘細菌培養於LB培養基及37℃條件。培養48h後，利用細菌基因組提取試劑盒提取每個菌株基因組並通過電泳或相關儀器檢測基因組質量。
2.2窖泥樣品基因組提取
窖泥樣品是從四川某著名白酒企業，保存於-80℃冰箱中。窖泥基因組提取參照李靖宇等人建立的方法［17］。
2.3梭菌特異性引物設計及其理論驗證
根據Ribosomal Database Project(RDP)數據庫中現有的16S rRNA基因序列，隨機下載相關的梭菌及非梭菌序列(優質序列且長度≥1200nt)。利用MEGA 5.0軟件比對並搜尋合適的僅對梭菌保守片段序列。然後將所得的序列輸入RDP數據庫進行比對，對其特異性進行理論驗證及對不同梭菌科覆蓋率計算，同時用同樣的方法考查以前文獻報道的梭菌特異引物的特異性及其對不同梭菌科的覆蓋率。最後確定候選引物送至上海生物工程有限公司合成且其中一個引物序列前添加GC夾子(5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)。
2.4PCR擴增
對新設計的梭菌引物退火溫度進行優化，溫度選取範圍為(54.5、56.5、58.9、60.9、62.2、63℃)。然後在最優擴增條件下擴增梭菌及非梭菌基因組，確定合適的循環數(15、20、25及30)以保證PCR擴增的特異性。另外，細菌通用引物選取P3-GC(5-CGCCCG CCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和P2(5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) ［18］。具體擴增體係及條件均與王海燕等人所用除模板和引物外其餘條件一致［19］。