目前,大多數的工業發酵屬於好氧發酵,在發酵過程中需要不斷地向發酵罐中供給足夠的氧氣,以滿足微生物生長代謝的需求。在實驗室,可以通過搖床的搖動,使空氣中的氧氣通過氣液界麵進入搖瓶發酵液中,而中試規模和生產規模的發酵過程則需要向發酵罐中通入無菌空氣,並同時進行攪拌,為微生物提供生長代謝所需的溶解氧。在各種產品的發酵生產過程中,隨著生產能力的不斷提高,微生物的需氧量也不斷增加,對發酵設備供氧能力的要求也愈來愈高。溶解氧濃度已成為發酵工業中提高生產能力的限製因素。所以,處理好發酵過程中供氧和需氧之間的關係,是研究最佳發酵工藝條件的關鍵因素之一。
一、發酵過程中氧的需求
(一)微生物對氧的需求
氧是構成微生物細胞本身及其代謝產物的組分之一。微生物細胞必須利用分子態的氧作為呼吸鏈電子傳遞係統末端的電子受體,最後與氫離子結合生成水。同時,氧在呼吸鏈的電子傳遞過程中可釋放大量的能量,供細胞生長和代謝使用。在好氧發酵中,微生物對氧的濃度有一個最低要求,滿足微生物呼吸的最低氧濃度稱作臨界溶氧濃度(critical value of dissolved oxygen concentration),用c臨界表示。
在c臨界以下,微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降。一般好氧微生物c臨界很低,為0.003~0.05mmol/L,需氧量一般為25~100mmol/(L·h)。其c臨界大約是氧飽和溶解度的1%~25%。當不存在其他限製性基質時,溶氧高於c臨界,細胞的比耗氧速率保持恒定;如果溶氧低於c臨界,細胞的比耗氧速率就會大大下降,細胞處於半厭氧狀態,代謝活動受到阻礙。培養液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧,保持供氧與耗氧的平衡,才能滿足微生物對氧的利用。液體中的微生物隻能利用溶解氧,氣液界麵處的微生物還能利用氣相中的氧,故強化氣液界麵也將有利於供氧。
微生物的好氧量常用呼吸強度和好氧速率兩種方法表示:
(1)呼吸強度(Qo2)呼吸強度即單位質量的菌體每小時消耗氧的量,單位mmol(O2)/[g(幹菌體)·h]。
(2)耗氧速率(γ)耗氧速率即單位體積培養液每小時消耗氧的量,單位mmol(O2)/(L·h)。
呼吸強度可以表示微生物的相對吸氧量,但是,當培養液中有固體成分存在時,測定起來有困難,這時可用耗氧速率來表示。微生物在發酵過程中的耗氧速率取決於微生物的呼吸強度和單位體積菌體濃度。
呼吸強度和好氧速率之間的關係如下:
γ=Qo2X(7-27)
式中X——菌體濃度,kg幹重/m3
從式(7-27)可知,微生物在發酵過程中的耗氧速率取決於微生物的呼吸強度和單位發酵液的菌體濃度,而菌體呼吸強度又受到菌齡、菌種性能、培養基及培養條件等諸多因素的影響。
(二)影響微生物耗氧的因素
分批培養過程中細胞好氧的規律。在培養初期,呼吸強度Qo2逐漸增加,此時菌體濃度很低。在對數生長期初期呼吸強度達到最大,但此時菌體濃度還較低,攝氧率並不高。隨著菌體濃度的增加,培養液的攝氧數量迅速增高,在對數生長期達到最大值。在對數生長期末期,由於培養基中營養物質的消耗以及培養裝置氧傳遞能力的限製,呼吸強度下降,雖然此時細胞濃度仍在增加,但其活力已經下降。培養後期,因基質耗盡,細胞自溶,呼吸強度進一步下降,攝氧率也隨之迅速降低。
以上適合呼吸強度的一般規律,這一規律受到以下因素的影響和限製:
1.微生物本身遺傳特性的影響
不同種類的微生物的耗氧量不同,一般為25~100mmol(O2)/(L·h),但也有少數微生物很高。同一微生物的耗氧量,隨著菌齡和培養條件不同而異,一般幼齡菌生長旺盛,其呼吸強度也大。但是種子培養階段由於菌體濃度較低,總的耗氧率也低。菌齡較大的呼吸強度弱,但是在發酵階段,由於菌體濃度較高,耗氧量大。
2.培養基的組成
培養基的成分和組成顯著地影響著微生物的攝氧速率,特別是碳源成分,好氧速率由大到小依次為油脂>葡萄糖>蔗糖>乳糖。一般來說,需氧量隨著碳源濃度的增加而增加。在發酵過程中如果進行補料或加糖,會使微生物的攝氧速率增加。例如,在鏈黴素發酵70 h後補加糖、氮前,攝氧速率為34.3×10-3mol/(m3·s),補料後78 h測得的攝氧速率為40.9×10-3 mol/(m3·s),92h後下降到(15~20)×10-3mol/(m3·s)。表7-12所示為不同碳源對青黴素攝氧率的影響。
3.發酵條件
pH、溫度通過影響酶活性而影響菌體細胞的好氧,而且溫度還影響發酵液中的溶氧濃度,溫度增高溶氧濃度下降。一般來說,溫度越高,營養成分越豐富,其呼吸強度的臨界值也相應增加。當pH為最適pH時,微生物的需氧量也最大。
4.代謝類型
若產物是通過三羧酸循環獲取的,則呼吸強度高,耗氧量大,如穀氨酸、天冬氨酸的生產。若產物是通過糖酵解途徑獲取的,則呼吸強度低,耗氧量小,如苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸的生產。
二、發酵過程中氧的供給
好氧微生物生長和代謝均需要氧氣,因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要。由於各種好氧微生物所含的氧化酶係(如過氧化氫酶、細胞色素氧化酶、黃素脫氫酶、多酚氧化酶等)的種類和數量不同,在不同的環境條件下,各種不同微生物的吸氧量或呼吸強度是不同的。因此,在發酵生產中,供氧的多少應根據不同的菌種、發酵條件和發酵階段等具體情況決定。需要指出的是,發酵過程中不需要使溶氧濃度達到或接近其飽和值,隻要將溶氧水平控製在臨界氧濃度以上,就可避免細胞因供氧不足發生代謝異常,也可避免過度的供氧引起的能量消耗和對細胞可能的傷害。
另一方麵,由於微生物在細胞生長階段和產物合成階段對氧的需求是不同的,因此需要適時和適量地給細胞提供氧氣,如采用分階段控製溶氧的策略,以獲得高生物量和高產物合成水平的統一。例如,穀氨酸發酵的菌體生長期,希望糖的消耗最大限度地用於合成菌體,而在穀氨酸生產期,則希望糖的消耗最大限度地用於合成穀氨酸。因此,在菌體生長期,供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量以獲得較高的生物量。但是,供氧並非越大越好,當供氧滿足菌體需要,菌體的生長速率達最大值,如果再提高供氧,不但不能促進菌體生長,造成能源浪費,而且高氧水平會抑製菌體生長。
由於空氣中的氧在發酵液中的溶解度很低,所以發酵工業中給發酵液通氣時,空氣中氧的利用率很低。例如,在抗生素發酵過程中,被微生物利用的氧不超過空氣中含氧量的2%;在穀氨酸發酵過程中,氧的利用率有10%~30%。所以,大量經過淨化的無菌空氣因無法溶解而被浪費掉。所以,必須設法提高傳氧效率,降低空氣的消耗量、設備費用以及動力消耗,同時減少泡沫形成和染菌的機會,增加設備的利用率。