一、微生物的分離
1.概述
近年大豆發酵食品工業不但采取了純粹培養微生物的生產工藝，而且開始對微生物進行科學的管理工作，因此有用菌的分離、選擇及添加很普遍。生菌的生理活性以及生菌數的考察等已成為必要的技術管理內容。為了研究闡明微生物在生產過程中的作用動態等，也需要從製曲、醪、醅以及成品進行微生物的分離，而大豆發酵食品所參與的微生物主要是黴菌、酵母及細菌。從黴菌中分離其他菌類，在技術上比較麻煩，現已有種種分離方法，各有其特點，應根據分離目的及要求，選用較適當的分離法是完全必要的。現將其分離法概要介紹於下。
照常法進行平板培養時，如有黴菌存在，則由於其繁殖旺盛，會將其他菌落遮蓋起來，不能形成菌落，故多采用抗菌素來抑製黴菌的生長，使之易於分離。例如加優洛殺菌素其濃度為3/105時，在以蛋白腖、酵母粉、葡萄糖為主的培養基中，即可抑製黴菌的生長。欲分離乳酸菌，可加乙醇酸鈉（1g/L）；分離酵母可加丙酸鈉（1/500）。為了從種曲中分離細菌，添加殺真菌素（Kabicidin），也是有效的方法。尤適合於酵母屬（Vacchromyces）生長的培養基中，加入殺真菌素（50μg/mL）pH6.8是具有選擇性的分離培養基。其法如下：葡萄糖10g、NH4Cl 3g、醋酸鈉10g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO410mg、精氨酸0.2g、苯丙氨酸0.1g、蛋氨酸0.2g、胱氯酸0.1g、生物素10μg、煙酰胺1mg、硫胺素1mg、水100mL。此培養基可防止多種乳酸菌的繁殖，如乳杆菌（Lactobacillus）、胚芽乳杆菌（L.plantarum）、清酒乳杆菌（L.sake）等。
從曲中分離純粹微生物，使用抑製劑的抗菌素較為方便，但並不是非用抗菌素不可，原等將米曲黴與殺菌水振蕩，做成曲汁瓊脂培養基，檢查製曲過程中酵母的消長情況，村上等用0.1%蛋白腖、曲汁培養基從曲、酒母、醪等分離出多種微生物。有研究人員曾用曲汁或麥芽汁變更培養溫度25、30、35℃，分離了產膜酵母，這些都是不同抗菌素分離結果的很好例子。
究竟何種方法主要決定於研究目的。下麵介紹一個釀造工廠所使用較為成功的分離方法，其特點在於利用溫差進行分離。一種試樣要用三個培養皿，將試樣放入含0.1%蛋白腖的曲汁瓊脂培養基的培養皿內，1支在15℃培養2～3周（A）；1支在28℃培養1周（B）；1支在32～34℃培養1～2d（C）。將各個菌落分離。A中出現的為青黴、毛黴、根黴、酵母及低溫細菌。至於曲黴僅有菌絲生長；B中主要為曲黴；C中主要為乳酸生產菌、枯草杆菌。為了確認枯草杆菌的存在，須另取1支培養皿，將試樣懸浮於無菌水中、於100℃加熱殺菌數分鍾。滴入加有CaCO3的培養基內，使之擴散，在32～34℃培養1～2d。
即使同一試樣，因分離法不同，所得結果亦未必盡同。最易於漏檢的為釀造工廠分布最廣的青黴及枯草杆菌；按常法分離極易得到“無”的錯誤結論。有時紅色酵母所出現的菌落，初為白色，易誤認為普通酵母，但放置10d後才逐漸變紅；低溫培養，紅色較為明顯，故仍以A法較為準確。枯草杆菌較易判別，因培養溫度不同，呈紅色、紫色的菌株也不少，故應在純粹分離之後，用不同溫度進行培養。
大豆發酵食品的微生物研究中，一般多以生菌為對象，因此平板培養法仍為生菌分離的有效手段。
2.酵母的分離
取試樣醬油或豆醬等10g，稱準後，加入100mL容量瓶，加水稀釋至100mL，激烈振蕩3min，用0.01mL刻度的1mL吸液管，反複進行10倍稀釋，至適當菌數濃度後投入直徑90mm培養皿，再加入培養基10～20mL，充分混勻，30℃培養3～10d。其他可按一般生菌數測定法進行。
培養基可采用豆醬或醬油成分為基礎，然後再補加葡萄糖及食鹽，一般稱MG培養基，其製法如下：用豆醬時加5～6倍水，在60℃水浴中浸泡2h，煮沸，用濾紙過濾；如用醬油，則將生醬油煮沸過濾，濾液測定其全氮及NaCl，稀釋至所需濃度。如糖分過多時，亦應測其含量。一般稀釋至全氮0.2%、葡萄糖5%～6%、NaCl 10%。
培養基NaCl濃度對生菌數的影響很大，耐鹽性酵母在滲透壓急劇變化時，會導致大量生菌死亡。因此，分離培養基食鹽濃度不適當時，必導致分離菌數相差懸殊。15%～18%濃度，會使分離菌數下降，而且菌落也較小，要根據酵母的耐鹽性選擇食鹽濃度，一般可用8%。
此外，稀釋用水的食鹽濃度對生菌數的影響很大，由於大豆發酵食品所用酵母大都是耐滲透壓的。故如用生理食鹽水（0.85%），試驗證明其生菌數減少是很明顯的。5%及15%的也有所減少，而以10%的生菌數為最多。用稀釋水進行懸浮酵母的時間越短越好，由於豆醬、醬油稀釋過程中會發生滲透壓的變化，應避免生菌數的損失，如從低鹽度的醬類或曲中分離酵母時應降低稀釋水鹽度。
酵母培養基從曲汁較為普遍，一般還須加入酵母膏或蛋白腖，以增加氮源。經過試驗證明用MG培養基（TN0.2%）可完全代替曲汁及酵母膏培養基，極適用於酵母的生菌數測定。
在釀造初期，會有大量曲黴孢子及根黴混入，因此在分離酵母時，應除去之。以前曾用添加0.2%丙酸鈉，pH4.6的曲汁培養基，目前尚無更強而具有選擇性的黴菌抑製劑，如加入0.2%丙酸鈉於MG培養基（TN0.2%、食鹽10%），雖可抑製根黴、米曲黴等的生長，但對酵母亦有影響，使其生長遲緩，不加丙酸鈉的，培養3d即可，如加丙酸鈉後延長到7d，不但菌落較小，而且很可能減少生菌數。
由於MG培養基含10%食鹽，pH4.6，故一般細菌不會生長繁殖。由於這種鹽度與低pH，芽孢杆菌及微球菌不會生長，鏈球菌係乳酸菌的耐鹽性很弱，片球菌又不耐這麼低的pH，都不會生長。從曲子分離酵母，常使用不加鹽的MG培養基或曲汁培養基，這時加入丙酸鈉雖可抑製黴菌的生長，但卻常常混生細菌類（特別是鏈球菌係乳酸菌及微球菌經常出現，有時還出現一部分芽孢杆菌），添加50μg/mL的四環素（Achromycin）即可防止細菌的生長，此劑在酸性或中性較安全，水溶性，使用方便，對酵母無影響。
3.球擬酵母的分離
具有強耐鹽性的球擬酵母屬中的一群，廣泛分布於醬油醪中，是支配後期發酵的重要酵母。據研究凡是優質的醬油醪均有球擬酵母存在。由於其生成的4-乙基愈創木酚賦予醬油以美好的香氣，為人所重視，開始應用於醬油醪及豆醬的添加。
關於該菌的分離及添加的研究並不多，目前多利用茂木氏等的球擬酵母分離用培養基。
球擬酵母的分離是利用魯氏酵母在高濃度食鹽存在下不同化發酵麥芽糖（或者很弱）的特性得以分離。至於其他雜酵母，則由於高濃度的食鹽而被淘汰。魯氏酵母的某些菌株，還是有較弱的同化發酵麥芽糖的性質，而且鹽度越高其同化性質及發酵性越弱，甚至在25%濃度的食鹽培養基中仍發現有魯氏酵母。因而在分離過程中很可能混入魯氏酵母。但在18%食鹽的培養基中魯氏酵母的生長非常緩慢，而且很弱，用肉眼不易辨別這兩種酵母的菌落，故此種分離球擬酵母的培養基，還是有其實用價值的。
球擬酵母群有硝酸鹽同化性，因此可與其他雜酵母分離。
4.細菌的分離
試樣中混有黴菌時細菌的分離，常用優洛殺菌素（Eurocidin），後又使用殺真菌素（Kabicidin）。最近有使用價廉的環己酰亞胺（Cycloheximide），對抑製黴菌及酵母的效果亦佳。以下是好井等介紹的分離豆醬、醬油中細菌用培養基B-1號。
殺真菌素對大豆發酵食品有關曲黴及酵母的抑製作用如表5-2當用量為200μg/mL時，對細菌並無抑製作用；100μg/mL對酵母已有相當強的抑製作用。醬油曲黴孢子數少時100μg/mL即可，孢子多時就需要200μg/mL。
如以分離乳酸菌為主要對象，混入的芽孢杆菌會影響其分離，用厭氧培養法可分離之。試樣多時可將大量培養皿裝入幹燥器或其他無氧狀態的裝置，此外，雖可用重層法遮斷空氣，但此法也難完全抑製芽孢杆菌的生長，並會混入少量芽孢杆菌，使判斷不準確。為此，可用對芽孢杆菌生長有專一性抑製作用的山梨酸，但此酸對接觸酶陰性的乳酸菌無抑製作用，隻對接觸酶陽性菌有抑製作用。
山梨酸的效果因pH而有很大的差別。由於山梨酸的抑菌能力是依靠非解離型分子的作用，在酸性中效果大。因此須將B-1培養基的pH調至5.0～7.0範圍內。表示了山梨酸對芽孢杆菌、鏈球乳酸菌生長的影響。芽孢杆菌在pH6.0、0.2%山梨酸存在下就可以被抑製，pH7.0，濃度增至0.3%尚不能抑製；鏈球菌及乳酸杆菌在pH5.5、0.15%～0.2%的山梨酸就可被抑製。如pH6.0增加濃度至0.2%抑製效果仍然很弱。pH5.0、0.3%不能抑製。至於微球菌即使不加山梨酸，隨著培養基逐漸變酸性，其生長也受到抑製。pH5.5、山梨酸濃度達到0.15%就可以完全抑製。但是一些耐酸性差的菌，如嗜鹽片球菌（Ped.halophilus），在pH5.5以下生長非常緩慢，甚至不再生長。在pH6.0的培養基中，即使不加山梨酸，生長也受到相當的抑製。添加0.2%的山梨酸後生長非常遲緩。為了抑製杆菌的生長，100μg/mL以下就可以達到目的。而乳酸杆菌則須500μg以上，鏈球乳酸菌則須要1000μg以上，微球菌也要300μg以上。因此利用山梨酸完全可以作為芽孢杆菌的選擇性抑製劑。
菌株生長馬鈴薯芽孢杆菌—巨大芽孢杆菌—枯草芽孢杆菌—蕈狀芽孢杆菌—蕈狀芽孢杆菌醬油變種。
當然，分離大豆發酵食品中乳酸菌也可以利用鹽度進行嗜鹽性乳酸菌的分離，即使用下列配方的10%食鹽分離培養基。
*添加生醬油使TN達0.4%，可代替蛋白腖或酵母膏。
這一配方較前B-1配方更適合於耐鹽性乳酸菌的分離。添加生醬油不僅有利於乳酸菌，而且對微球菌生長也有促進作用。