製曲是培養好曲黴以生成強大蛋白水解酶係為主要目的的工程。將曲黴培養於原料上，在製曲過程中，曲黴的生長或產酶以及混入微生物生長的影響因子有原料配比、C/N比、水分、濕度、溫度、通風及製曲時間等基本製曲技術條件。
其中營養是曲黴的培養基，必須有足夠曲黴生長所需要的營養成分。根據目前所用原料，不管是大豆、脫脂大豆（豆粕）和小麥或脫脂大豆和麥麩是不成問題的，而且其氮源特別豐富而有餘，非常適合於以後混入微生物如芽孢杆菌及產酸菌的繁殖。因此，脫脂大豆和小麥或麥麩的比例，即原料配比對曲黴的生長或產酶產生微妙的影響。
曲黴屬好氣性菌，繁殖時需要氧。機械製曲時的通風或曲盤、竹匾製曲時的開閉天窗不單純是調節溫、濕度，同時也有輸送氧氣促使曲黴生長的作用。
對曲黴生長和產酶影響最大的是培養溫度，當然曲料的水分和製曲環境的濕度也是決定製曲質量不可忽視的重要因素。為了製好曲，還要注意一些細微條件的實施，作為獲得優質曲的保證。
製曲初期乳酸菌的繁殖對曲料pH的變化起著決定的作用，其pH變化對曲黴的生長和酶的生成及活性都會產生影響。初期培養時的pH大體上是一定的，一般在pH6左右，如果乳酸菌發酵正常，一般pH下降到4.5～5.0而告終。
另外，構成製曲條件的因素多，而且互相交錯，對製曲的成績產生著複雜的影響。下麵就將製曲主要條件，並結合對酶生成的影響加以敘述。
一、原料配比、碳氮比與酶的生成
1.原料配比
我國醬油所用原料有大豆（或脫脂大豆）與小麥及脫脂大豆與麥麩兩種。前者多用於生產傳統醬及高檔醬油，後者用於普通低鹽固態發酵醬油，但也添加少量小麥以獲得糖分較高或進行有酵母參與的固稀發酵醬油。現在主要闡述一下以大豆、小麥為原料不同配比對醬油釀造的影響。
將大豆及小麥配比分為18組（大豆∶小麥=85∶15～0∶100），進行製曲，考查小麥使用比例的醬油曲的分析值及產酶與各種配比的醬油分析值之間的關係值，其結果是隨著小麥比例增加，出曲的轉化糖、糖消費量、出曲質量、甲殼質含量均高。另外，酸性蛋白酶、酸性羧基肽酶、果膠酸液化酶，澱粉糖化酶，液化酶的生成量也多；醪液中的酒精、酒精/全氮、滴定酸度/全氮、還原糖、還原糖/全氮、醬醪黏度、經氧化的醬油或熬油後的醬油的色澤或氧化褐變程度都趨向於高數值。換句話說，小麥的配比越大，曲黴的生長越好，其消耗葡萄糖的量也越大，醬油的pH也低，偏向於酸性作用的酶的生成也多。
與此相反，大豆的比例越大，出曲的pH、出曲的水分也越高；β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果膠裂解酶、穀氨酰胺酶E、亮氨酸氨基肽酶β和亮氨酸氨基肽酶G、堿性蛋白酶M和S、木聚糖酶、全蛋白酶S和M、中性蛋白酶S、果膠糖化酶等酶的生成均旺盛。另外，醬油醪汁液中的全氮、氨基酸態氮、氨基酸生成率（氨基態氮/全氮）、氨基態氮、pH、穀氨酸、醬醪消化度、食鹽濃度等有提高的趨勢。總之，大豆的配比越大，醬油的pH越高，堿性、中性蛋白酶的生成也越多。
因此，醬油釀造特別需要堿性和中性蛋白酶、亮氨酸氨基肽酶、穀氨酰胺酶等酶類，以增加大豆的比例為有利。
小麥使用的比例為70%時，穀氨酸生成率最高。這與多使用小麥時，穀氨酰胺酶生成的不好有關係，出曲時pH較低，使醪液pH偏低都有關係。這些數據引自日本村上英也“曲學”一書，有相當的參考價值，故錄之於此。
至於脫脂大豆與麥麩的配比問題，請參閱下麵C/N比。製曲為了獲得較好的強大酶係，從所得的產品來講，就嫌澱粉原料不足，產品缺少糖分，也不夠微生物進行發酵時充分生長和發酵所需，影響產品風味。
2.碳氮比與酶生成的關係
黴菌的生長或酶的生成都需要適當的C/N比，米曲的原料大米中碳源多，N源少；製造豆曲時就相反，N源多而碳源少；而麩曲的C/N比較恰當。醬油曲的配比為豆餅∶麥麩=60∶40或65∶35，其C/N比大致為1∶1。
N源多時，堿性蛋白酶（AIP）及中性蛋白酶（NP）生成的較多，而酸性蛋白酶（ACP）則減少。米曲蛋白酶的主體是ACP，其原因是N源少，C/N比值大，大米的精白度差；N源越多，蛋白酶生成的也越多，特別是AIP及NP的比例也增大。另一方麵，豆曲則以NP及AIP為主，ACP很弱。這是由於碳源少，C/N比很低的緣故。如與米並用，提高C/N，ACP的生成就特別顯著地增大，米曲黴液體培養，C/N比增高，ACP也隨之增大，而NP、AIP隨之減少。
由於C/N的不同而發生蛋白酶組成的變化，主要是起因於製曲pH經過的不同，pH經過的差別是由於曲黴代謝，尤其是NH3生成量的不同所引起。
當pH接近堿性時就形成了AIP，而ACP隻有在酸性才形成，人為地改變曲料基質的pH，可以改變NP∶AIP的比例。
曲子pH的變化，特別是製曲後期pH的上升，主要是由於曲黴代謝所生成的NH3而引起的。C源越多，NH3就被抑製，曲子的pH就低；相反，N源多就多生成NH3，pH上升就越明顯。一般利用黴菌生產水解酶，NH3的生成大致與酶的生成平行，到了這一階段曲黴的主要代謝已由菌絲的增長轉到酶的生產，這是一般的情況，有時因C/N比的變化氨的生成情況也有所不同。N源多，C/N比小的培養基上所生長的菌絲，多積累含氮化合物，這樣的菌絲在自我呼吸時，庫存氨基酸、蛋白質、核酸、核糖等就優先被利用，產生大量氨。相反，碳源多，C/N比大的培養基中所生成的菌絲，當其進行自我呼吸時，首先利用其庫存的糖類、脂類等，而後才利用含氮貯存物質、所以很少生成氨。這時參與生成氨的酶（酰胺酶、氨基移轉酶、脫酰胺酶）隨著葡萄糖的缺乏或碳水化合物的低下而增加。
主要製曲原料的C/N比列，大米的C/N比大致是10～12，小麥是6～7，玉米麵為8，麥麩是3～4，米糠是2，大豆、豆餅是0.5～0.4。使用C/N特別偏向於一方的製曲原料，必然會導致製曲操作上的困難，製曲的酶活一般弱，因此一般多采用兩種以上原料的配合方法。曾進行多次比較，以豆餅（6）∶麥麩（4）的混合製曲（C/N比約為1.1），麥曲、米曲，雖然都是米曲黴在同樣培養條件下製成的曲，其蛋白酶活性按順序而降低。同時變更了豆餅與麥麩的混合比例，進行了C/N比與蛋白酶活性的關係試驗，總的說來，麥麩較多，活性較強，豆餅與麥麩等量混合（C/N比約1.35）最好。與山本所作試驗結果大致相同。浜田認為豆餅（55）∶麥麩（45）（C/N比大約1.24）的混合製曲酶活最好。液體曲的培養基以3%大豆粉為N源，3.5%葡萄糖為C源（C/N比約為3.0），酶的產量達到最高。
改變製曲原料配比（大豆∶小麥=85∶15～100）考察了小麥使用比率與醬油曲分析值與酶活之間的關係，其結果是隨著小麥使用量的增加，出曲的轉化糖、糖消耗量、出曲質量、甲殼質（菌體）含量增加，酸性蛋白酶、酸性羧基肽酶、果膠酸液化酶、澱粉糖化酶、澱粉液化酶的生成也多。同時也發現醬醪中的酒精、乙醇/全氮、滴定酸度/全氮、還原糖、還原糖/全氮、醬醪黏度、醬油的色澤氧化褐變程度都高。總括起來講，小麥使用量越多，曲黴的繁殖越好，曲黴消耗的葡萄糖量也增加，醬油曲的pH也低，偏酸性側的酶活也越高。
與此相反，大豆的比例增加，出曲pH，出曲水分均高，β-糖化酶、β-果糖化酶、果膠酶、亮氨酸氨基肽酶Ⅰ及亮氨酸氨基肽酶Ⅱ，堿性蛋白酶M和S，纖維素酶、中性蛋白酶等均旺盛。醪液中的全氮、氨基酸態氮、氨基態氮/全氮、pH、穀氨酸的濃度較高。亦即隨著大豆使用比例的增加，醬油的pH較高，堿性、中性側的酶活均較高。因此，醬油釀造過程中所必需的堿性、中性蛋白酶、亮氨酸氨基肽酶、穀氨酰胺酶等酶類，隨著大豆使用比率的增加，其生成也多。
小麥使用比率占70%時穀氨酸/全氮的比值最高，這與小麥的穀氨酸/全氮高有關，與穀氨酸酶的生成不好，醬醪經過長時間的低pH有關。
3.製曲pH變化對蛋白酶的影響
在製曲過程中，初期pH的逐漸降低是由於有機酸的生成；後期由於NH3的產生而pH逐漸回升，水解酶的生成與氨的代謝有平行關係。因而隨著pH的上升，蛋白酶活性也逐漸增高，如前所述將米曲的pH進行緩衝之後是可以改變ACP、NP、AIP的活性，將米曲黴進行液體培養、pH調至接近堿性範圍，AIP的生成量就較多，最終pH接近中性到偏酸性時，生成較多的ACP。製曲時添加生理的堿性物質（穀氨酸鈉、硝酸鈉等）或有機酸的鈉鹽或鹽基性磷酸鹽等，以提高製曲時的pH，這樣可以促進AIP的生產，抑製ACP的生成。相反，添加生理的酸性物質或酸性磷酸鉀等，可以抑製AIP的生成。