同年3月，蔣介石又設立了精神總動員會，自兼會長，製定《國民精神總動員綱領》，提倡“精神之改造”，其中所謂“分歧錯雜之思想必須糾正”（見重慶《中央日報》1939年3月22日），矛頭顯然指向中共及共產主義。5月，蔣親自在重慶主持精神總動員誓師大會及遊行。從表麵上看，全國精神總動員為了抗日救國，然觀其要人民“行大孝”“盡大忠”，而以三民主義為名，行一人一黨獨裁之實，達到“軍政軍令及行政係統之統一”等，則骨子裏“防共”實甚於抗日。益知抗戰戰場上呈現退守局麵後，蔣介石已將重心由抗日轉向“防共”矣。
這一年的11月下旬，周恩來在延安受傷，電請重慶航空委員會派飛機送莫斯科治療，但航委會無機可派，結果延安請莫斯科派飛機來迎。蔣介石聞之甚怒，“責令航委會一定派機去接送，不許蘇聯機來迎”。（見唐縱《在蔣介石身邊八年》，第103頁）航委會起初不肯派機，豈非秉承蔣的意誌？及見“偷雞不著將蝕把米”，乃大發脾氣，責令派機，何前倨而後恭也？這件小事足見蔣氏心事之大。
小事之後，即有大事。同年年底，蔣介石就命令胡宗南東自黃河西至甘肅西峰，構築堡壘群，猶如第五次“圍剿”的工事，以包圍陝甘寧邊區，企圖進取延安。朱德、彭德懷對蔣之軍事進攻，做政治性的反擊，通電全國，指責槍口對內。（電文見《國民參政會實錄》上冊，第724—725頁）1940年3月初，中共十八集團軍（八路軍）參謀長葉劍英到重慶參加會議，報告國共摩擦事實的原因，但蔣介石聽後，避而不答，“一字不提”。（見唐縱《在蔣介石身邊八年》，第719—720頁）到4月間，蔣主持國民參政會一屆五次會議，才由何應欽做軍事報告，指責延安自組政府、擅設銀行、發行紙幣、擴充軍隊，造成割據，以為“嚴厲製裁”的依據。國共關係至此，自然日見惡化，山西、河南一帶竟發生大規模衝突，中共乃發動政治攻勢。蔣既無法決裂，最後隻好命衛立煌與朱德在洛陽談判。朱德提出共產黨合法化、保護《新華日報》、釋放被捕中共人員、停止進攻共軍等要求。這些要求合情合理，蔣雖不可能接受，然在政治上已使他甚感被動的壓力。但他絕不罷休，命陳立夫擬具對策，約有三項：
第一，統一黨內同誌對共產黨問題之認識，使共黨無所施其挑撥離間之技。第二，建立軍事政治根據地，以防範共黨勢力之蔓延，並進而逐漸縮小其占據區域（如魯冀邊區、陝北邊區等）。第三，根絕共黨在後方各省之活動。（唐縱《在蔣介石身邊八年》，第134頁）
蔣介石按此方案，於1940年7月中旬提出“提示案”，亦做“防止案”，要點有四：其一，將陝甘寧邊區改稱陝北行政區，限十八個縣，暫隸中央政府行政院管轄；其二，取消冀察戰區，劃定第十八集團軍及新四軍作戰地區，並入閻錫山的第二戰區，以朱德為副司令長官，秉承軍事委員會命令，指揮作戰；其三，命十八集團軍及新四軍於一個月內，開往規定地區之內；其四，第十八集團軍準編為三軍六師、五個補充團，新四軍準編為兩個師。（參閱蔣介石《蘇俄在中國》）其目的顯然想要嚴格規範共軍活動區域與兵力，而後加以防堵。然而在抗戰期間，又如何來阻止紅軍的抗日，特別是敵後的活動？此時國際局勢更加不利，越南、緬甸均遭封鎖，使重慶更為孤立。不少人主張重新揭舉孫中山三大政策，聯蘇聯共，朱毛也通電做此要求。（見唐縱《在蔣介石身邊八年》，第143頁）但蔣寧願走另外一條路，暗中積極進行蔣日和談（參閱本書前一節），國共間矛盾更趨緊張。
1940年10月19日，共軍正在進行百團大戰時，蔣介石忽命何應欽、白崇禧聯名向共軍首領發出皓電，指責共軍不守戰區範圍、自由擴充、不服從中央命令、不打敵人而並吞友軍。據此限令第十八集團軍與新四軍於一個月內開到黃河以北地區，非奉命不得擅自越出地境線外。蔣介石真正的心病則是，新四軍所占地盤是蘇、浙、皖三省的戰略黃金地區，一旦戰爭結束，華東重鎮很可能落入中共手中，當然嚴重關切，一再跟駐渝中共代表周恩來交涉，要新四軍搬家。（參閱孟絕子《蔣介石的報應——顧祝同大屠殺的結果》，第1—10頁）一個月後，朱德等共軍將領發表佳電，一麵揭露反共陰謀，向國民黨做政治攻擊；另一方麵表示願將新四軍開往長江以北，向國民黨做軍事讓步。蔣遂於12月9日以委員長命令發布手令，準予寬展時限，令江南之新四軍限於同月31日前開到江北地區，明年1月30日開往黃河以北地區。在黃河以南之第十八集團軍則限於12月31日開往黃河以北。（手令原跡見《苦心孤詣堅苦卓絕》，第224頁）可見蔣介石處心積慮要把所有共軍都趕到黃河以北去。到1940年12月下旬，江南的新四軍十萬人馬已大都北移。
然而當剩下的新四軍軍部及三個支隊共約九千餘人準備北移時，如按照顧祝同畫好的路線，就會走入日軍重炮的虎口，於是周恩來向蔣要求改變路線，蔣佯允之，然而於1941年元月6日行至茂林一帶時，突遭蔣介石嫡係部隊，由顧祝同、上官雲相所轄的八萬餘眾圍殲，血戰七晝夜之後，僅兩千餘人突圍，其餘四千餘人或死或俘。軍長葉挺被俘，參謀長（應為副軍長、政委——編者）項英遇害。斯即轟動一時的“皖南事變”。
本來在兩年多前，毛澤東從軍事和政治上大處著眼，早已指示新四軍盡快深入敵後，開展獨立自主的遊擊戰爭。周恩來還於1939年2月親自向新四軍傳遞“向南鞏固、向東作戰、向北發展”的方針。1940年9月19日，中共中央望葉挺、項英“率部迅即渡江，增援皖東”。三天之後，朱毛又再度電催。但項英舍不得已經建立的根據地，一心想“株守皖南”。當蔣介石、何應欽、白崇禧等急電如火、磨刀霍霍，毛澤東更促葉、項盡速渡江，以皖東為根據地。皓電發後，毛更明言：“如留皖南，須準備打內戰，並蒙受政治上不利，望考慮。”（引自黃開源等撰《皖南事變及其曆史教訓》，《安徽師大學報》（1981）三，第20頁）葉、項雖於10月中旬派一個挺進團北上至無為，但仍下不了北移的決心。項英仍屢向中央列舉北渡的困難。同年11月24日，延安又致電葉、項：“你們必須準備於12月底開動完畢。”11月30日，毛又電令葉、項：“現在開始分批移動，12月底移完。”新四軍到12月3日才開始移動部分非戰鬥人員，完全不知情況緊急，還夢想要國民黨發餉彈後再開動。最後毛澤東在12月26日複電中，嚴厲批評項英，其才於兩天後立即北移，但又選擇了錯誤的北上路線（詳閱同文，第21—22頁），更加延誤時機，並墜入國民黨軍隊的包圍圈之內，於1941年元月14日被殲。