1941年1月4日，新四軍9000餘人從皖南雲嶺駐地出發繞道北上。6日，在涇縣茂林地區突然遭到8萬餘國民黨軍隊的嚴密包圍和猛烈襲擊。新四軍將士雖奮力拚殺，終因寡不敵眾，除2000餘人突圍外，大部被俘、失散或犧牲。奉命同國民黨軍隊談判的軍長葉挺被扣；副軍長項英、政治部主任袁國平、參謀長周子昆等遇難。這就是震驚中外的皖南事變。1月17日，蔣介石反誣新四軍“叛變”，宣布取消新四軍，將葉挺交付軍事法庭審判，將第二次反共高潮推向頂點。
該不該與國民黨決裂實行全麵反擊呢？毛澤東此刻非常冷靜。他認為我們不能怕決裂，要采取強硬的態度，實行全麵的政治反攻，軍事上要做好充分的準備，但不能馬上與國民黨大打起來。1月17日，毛澤東根據劉少奇的建議，最終確定了“政治上取全麵攻擊，軍事上取守勢”的方針，以徹底粉碎國民黨頑固派發動的第二次反共高潮。
在這一方針的指導下，中共中央為反擊蔣介石的第二次反共高潮做了周密的部署。1月18日，延安《新華日報》發表了中共中央發言人的談話，揭露皖南事變的真相，痛斥蔣介石1月17日的反動命令，呼籲一切愛國軍民同胞，全世界同情中華民族解放事業的公正人士，“與我們站在一條戰線上，反對少數親日分子及民族敗類，打破他們的內戰外和、投降賣國的無恥陰謀。”
1月20日，中共中央軍委發布毛澤東起草的重建新四軍軍部的命令，任命陳毅為新四軍代理軍長，張雲逸為副軍長。劉少奇為政治委員，賴傳珠為參謀長，鄧子恢為政治部主任。同時，毛澤東以中共中央革命軍事委員會發言人的身份向新華社記者發表談話，提出了共產黨關於解決皖南事變的十二條辦法：第一，懸崖勒馬，停止挑釁；第二，取消1月17日的反動命令，並宣布自己是完全錯了；第三，懲辦皖南事變的禍首何應欽、顧祝同、上官雲相三人；第四，恢複葉挺自由，繼續充當新四軍軍長；第五，交還皖南新四軍全部人槍；第六，撫恤皖南新四軍全部傷亡將士；第七，撤退華中的“剿共”軍；第八，平毀西北的封鎖線；第九，釋放全國一切被捕的愛國政治犯；第十，廢止一黨專政，實行民主政治；第十一，實行三民主義，服從《總理遺囑》；第十二，逮捕各親日派首領，交付國法審判。
遵照毛澤東和中共中央的指示，各抗日根據地軍民嚴陣以待，並紛紛發出通電，強烈聲討頑固派破壞抗戰的罪惡行徑。以周恩來為書記的中共中央南方局在重慶同國民黨頑固派展開談判鬥爭，並在宣傳戰線進行了猛烈攻擊。
中國共產黨的這種以民族利益為重的正義自衛立場，贏得了廣泛的同情和支持。各界人士、各民主黨派紛紛致電、致函蔣介石及國民黨中央，呼籲團結，反對分裂。國際上，對國民黨頑固派的反共高潮，不僅蘇聯表示反對，美英等國也很不滿意。