進入20世紀後，微生物學獲得了空前的發展，研究重點也逐漸轉移到了生化水平及分子生物學的水平上。自從德國學者布希納（E.Buchner，1860—1917年）發現了酒化酶之後，微生物的發展就深入到了生化水平。1901年德國人瓦爾德斯（E.Wildiers）發現酵母菌酵母菌不能合成對其自身生長所需的全部成分，需要外界加入稱為“Bios”（即VB1複合物）的生長因子，同時還發現在麥芽中存在這種可透析的、耐熱的“Bios”。1904年英國人哈登（A.Harden）和永（W.J.Yong）等又發現酵母菌榨取汁經透析後會失去其發酵活性，從而證明了輔酶的存在，同時他們還發現磷酸鹽能促進酵母菌榨取汁的酒精發酵過程，並從中分離出有機磷酸化合物。
在20世紀20年代初期，劍橋大學的斯蒂芬森和誇斯特爾（J.H.Quastel）對細菌酶是脫氫酶進行了研究，他們利用通伯技術（在裝有給氫體、細菌懸液和美藍的排氣管中測定美藍脫色的時間）對多種細菌的脫氫酶進行了一次係統的研究，在當時關於細菌合成代謝的知識極少或根本沒有，所以斯蒂芬森他們的研究工作具有極大的引導意義。但關於由分解代謝途徑產生的能量怎樣貯藏及轉變為動能問題，仍然未能解決。1930年，卡斯特隆（Karstrom）第一次把細菌中的酶劃分為組成酶和適應酶，適應酶在細胞中檢測不到或者是以很低的濃度存在，但當把他們的作用底物加入到培養基中時這些酶的含量就會在很短時間內，並且在細胞不增殖的情況下明顯的增加。
在20世紀初，由於微生物的拮抗現象大量存在已經被證明，並且證實在某些情況下，這種作用是由會擴散的抗生物質引起的。於是各式各樣的青黴素菌株和銅綠假單胞菌成了學者們爭相研究的對象，並對它們用於治療疾病的可能性進行了評價。在這種熱潮的推動下，1928年，英國微生物家弗萊明（A.Flemming）在研究葡萄球菌的菌落形態時，金黃色葡萄球菌在甘露醇鹽平板上的菌落平板偶然被汙染了點青黴，隨後發現其菌落周圍葡萄球菌的菌落顯示出溶解的跡象。經過一係列的實驗，他從培養物的濾液中提煉出這種可以溶解葡萄球菌的抗菌物質，並把它叫做青黴素，但當時這種青黴素並不能被推廣應用。直至1940年牛津大學病理學教授福樓雷（Howard Florey）提取和精製出了可用於人體肌肉注射的青黴素藥品，青黴素才得以推廣應用。
青黴素的發現重新引起了人們對土壤微生物可以產生抗生素這一現象的興趣。1944年，俄裔美國人瓦克斯曼瓦克斯曼畫像（S.A.Waksman）分離出第二種實用的抗生素——鏈黴素，鏈黴素的發現可以說是對青黴素的一種理想補充，因為青黴素隻能作用於革蘭氏陽性菌，即能夠用革蘭氏染色染成深藍或紫色的細菌，而鏈黴素則可以作用於革蘭氏陰性菌（不能被革蘭氏染色的細菌）以及使用青黴素無效的分枝杆菌，這樣兩種抗生素彼此代替使用便可以對付各種細菌。20世紀40年代中期以後，人們從放線菌、細菌和真菌中已先後提取了5500種以上的抗生素，其中有4000多種為放線菌產生，其餘為細菌和真菌所產生，但臨床上應用的不過100多種，人類最常用的也隻有幾十種。至今人們仍在繼續尋找新的抗生素，新的化合物也在不斷的湧現，這種狀況就好像細菌和微生物學家之間的賽跑。細菌不斷地產生對那些常用抗生素有抗藥性的突變菌株，而微生物學家則在百折不撓地尋找細菌還沒有來得及形成抗藥性的新化合物。