第二次世界大戰一開始，德國潛艇就顯示出它令人難以預料的戰技術優勢。為了與德國潛艇抗衡，英國海軍成立了幾支獵潛艦隊，每支獵潛艦隊均由1艘航空母艦和4艘驅逐艦組成，企圖以此打擊德國潛艇的囂張氣焰。盡管這一設想較為“可愛”，但它卻是錯誤的。因為，這一設想的執行即意味著“競技神”號、“勇敢”號、“暴怒”號和“皇家方舟”號脫離主力艦隊，而被派到西海岸和其他類似海域進行巡邏，期望它們的飛機能夠支援常常遭到德國潛艇攻擊的護航船隊。但由於航空母艦體積龐大，易於被攻擊，故英國人不敢輕易讓他們的航空母艦駛入德國潛艇經常出沒的海域，而且，當時航空母艦上的飛機性能還較差，不太容易擊沉潛艇。1939年9月14日，盡管英“皇家方舟”號發現了德國“U-39”號的潛艇航跡，但其飛機卻未起任何作用。相反，倒是擔任警戒的驅逐艦以深水炸彈給德潛艇以重創。3天後，德國潛艇看準了英航空母艦的弱點，“U-39”號潛艇以3枚魚雷命中“勇敢”號航空母艦，一舉擊沉了它，578名官兵隨艦體沉人大海，無一生還。“勇敢”號被擊沉，引起了英國全國震驚，其餘的航空母艦立即撤回。
在沒有先進的艦載機和優秀的艦載飛機飛行員的情況下，航空母艦不但難以與潛艇相抗衡，甚至連一些中小型艦艇也難以對付。1939年6月7日，英國海軍的航空母艦“光榮”號攜載著本艦的“劍魚”式飛機和皇家空軍的部分“鬥士”式和“颶風”式戰鬥機航行到納爾維克以西海麵，突遭德國戰列巡洋艦“沙恩霍斯特”號和“格奈森諾”號的堵截。護衛“光榮”號航空母艦的兩艘驅逐艦邊施放煙幕掩護邊全力還擊，並有一枚魚雷命中了“沙恩霍斯特”號，但由於航空母艦上停有空軍的飛機，本艦飛機難以升空作戰，故不久就被德艦擊沉，另外兩艘護航驅逐艦也被擊沉，3艘軍艦隻有46人幸存。
真正奠定了航空母艦在海戰中的地位和作用的是在珍珠港海戰。1940年12月7日上午7時30分，一支擁有6艘航空母艦、2艘戰列艦、2艘巡洋艦和9艘驅逐艦的日本艦艇編隊，在大霧茫茫之時，頂著滔滔巨浪駛達夏威夷群島北部離瓦胡島230海裏的海域，企圖一舉消滅駐泊於瓦胡島上珍珠港口的美國太平洋艦隊。7時55分，艦隊的350多架艦載飛機，攜帶著航空炸彈和魚雷，分兩批直向珍珠港撲去。這天正值周末，美太平洋艦隊除個別艦艇外出執行任務，其餘全都駐泊港內。許多官兵都到岸上去度周末，留在艦上的軍官和水兵也起得很晚。就在日本首批海軍飛機抵達珍珠港上空的時候，瓦胡島艦群的煙囪連一縷輕煙也沒有升起，港內的艦船可以說才剛剛蘇醒。當日本首批飛機已在珍珠港內艦群上空盤旋時，美海軍樂隊還在奏國歌，升國旗，直到國旗升到一半時，日本飛機投放下第一枚魚雷，人們這才開始醒悟，驚呼：“空襲！空襲！這不是訓練！”頓時，艦上官兵亂作一團，驚恐萬狀。僅1小時35分鍾時間的襲擊，日本海軍航空兵就把美太平洋艦隊的舛艘戰艦、389架飛機、4570多人炸得傷的傷、沉的沉。
日本海軍以航空母艦編隊偷襲珍珠港取得成功，以及日本海軍在偷襲珍珠港之後的第三天，為衝破英國人的封鎖而擊沉了英國的一艘號稱永不沉沒的“威爾斯親王”號戰列艦的事實，徹底打破了戰列艦統治大海的神話，使航空母艦一躍而成為海戰場上的重要角色。可以這樣說，珍珠港事件是航空母艦發展史上的裏程碑，它宣告了航空母艦的崛起和戰列艦時代的結束。此後，美國海軍盡管沒有正式頒布文件，但實際上已放棄用戰列艦作為艦隊的主力，而改為航空母艦特混編隊作為海戰的主要作戰力量。
在第二次世界大戰中，隨著太平洋戰爭的日益擴大，美日等國運用航空母艦大打海上空戰。如1942年6月4日～1942年6月6日的中途島海戰，海戰主要是由艦載航空兵進行的，海戰的勝負即由航空兵擊傷敵方航空母艦多少而決定的。同樣，在1942年5月的珊瑚島海戰中，日本人沒有發射一發炮彈，僅憑航空母艦的巨大威懾力就取得了戰略和戰術上的勝利。此外，1942年8月24日的東所羅門海戰和同年10月26日的聖克魯斯海戰以及幾次大的海戰和登陸作戰，都是由於航空母艦參戰而決定勝負的。為此，在第二次世界大戰期間，有的大國就一邊建造新艦，一邊把一些商船和戰列艦等也改成航空母艦。例如日本1940年投入營運的3艘L7萬噸級的豪華郵船“新田丸”、“八幡丸”和“春日丸”，由於通往歐洲的航線被戰爭所切斷，於是被用來改裝成為3艘名為“大鷹”號、“衝鷹”號和“雲鷹”號輕型航空母艦。改裝後的航空母艦航速21節，載機30架。1940年10月，日本海軍將日本郵船公司的兩艘27萬噸郵船進行改裝，命名為“飛鷹”號和“隼鷹”號，於1942年夏季編人現役，其排水量2414萬噸，載機53架。這是日本第一批把煙囪裝在上層建築上的航空母艦，其煙囪呈26度斜角外伸，使煙塵不會漂到飛行甲板的上方；1941年，日本人根據1939年製定的“04”計劃建造了一艘新型航空母艦“大風”號，令人難以理解的是，日本人建造的這艘新型航空母艦除煙囪成26度角外伸，艦艏和煙囪都是封閉式以外，竟與英國海軍的“光輝”級航空母艦很相似，該艦排水量293萬噸，航速33節，能搭載53架飛機和21架飛機備件，該艦1944年加入艦隊。