一、 緒言
家蠶病毒病是生產上危害最嚴重的傳染病，特別是夏秋蠶發病更多，往往占全部蠶病的7０%~8０％。家蠶病毒病除血液型膿病發病較快外，均屬慢性傳染病，蠶在感病初期外觀無任何症狀，一般要在感病後4~5天才出現症狀，但此時已接近晚期。病蠶是通過帶毒蠶糞傳染的，因此及早診斷並采取一定措施，可防止病毒病的擴散與蔓延。
對於家蠶病毒病的診斷除胃腸型膿病（CPV）在患病後期可由中腸病變及鏡檢有無多角體來確診外，傳染性軟化病（FV）及濃核病（DNV）由於病毒不形成包涵體，普通顯微鏡無法檢查，因而過去隻能用生物測定法進行診斷，但此法費時多，確診後已無法挽救。稍後對FV曾用組織化學法進行診斷，此法亦需在感病後期才能檢出。二十世紀七十年代初期國外應用血清學方法對家蠶病毒病進行早期診斷。此法能在蠶感病初期（感染病毒後24~48小時）進行確診。我國於七十年代後期正式開始了家蠶病毒病血清學早期診斷的研究。血清診斷法即利用抗原抗體的特異反應而進行診斷的方法。在蠶病診斷上是采用特定抗體去檢查病蠶體內有無相應抗原（病毒），主要有玻片沉澱法、環狀沉澱法、免疫電泳法、雙向擴散法及對流免疫電泳法等，現將確診率高且在實驗室廣泛應用的雙向擴散法及對流免疫電泳法介紹如下。
二、 雙向擴散法
雙向擴散法抗原抗體在瓊脂凝膠內起沉澱反應的一種方法，這種方法不但能檢出微量抗原或抗體，且能根據沉澱帶的形態了解抗原或抗體之間的相互關係。
器具和藥品
托盤天平（附砝碼）、溫箱、有蓋瓷盤、小瓷盤染色缸（臥式）、電爐、水平尺、可調三足架、打孔器、吸量管（０．2ml、1ml、2ml）、試管、漏鬥、燒杯（5０ml、1００ml、25０ml、4００ml）、細口瓶（5００ml、1０００ml）、量筒（25ml、1００ml，5００ml）、玻璃板（7cm×9cm）、研缽、研棒、鋁鍋、鑷子、大飯盒、滴管、濾紙、電泳瓊脂、巴比妥、巴比妥鈉、氯化鈉、氨基黑1０B、冰醋酸、碳酸鈉、疊氮鈉（NaN3）。
抗血清： 目前已製備有抗CPV血清及抗DNV血清。
實驗準備
1. 試劑配置：
（1） ０．０5mol/L、pH值8．6巴比妥緩衝液： 巴比妥鈉1０．3克、巴比妥1．84克加蒸餾水至1０００毫升，完全溶化後置冰箱備用。
（2） ０．3％碳酸鈉溶液：碳酸鈉０．3克加蒸餾水1００毫升。
（3） 1N醋酸：分析純冰醋酸58毫升加蒸餾水至1０００毫升。
（4） 1％氨基黑：氨基黑1０B1克加1N醋酸1００毫升。
（5） 生理鹽水：氯化鈉8．5克加蒸餾水1００毫升。
2. 瓊脂板澆製： 電泳瓊脂1克加巴比妥緩衝液1００毫升，隔水煮沸使瓊脂全部融化，加入少量NaN3用玻棒輕輕攪動一下，然後用四層紗布過濾，同時將幹淨玻片放在事前已校正好的水平台上，將已融化的瓊脂液趁熱慢慢倒在玻板上。7cm×9cm的玻板一般澆14~15毫升瓊脂，可先將熱瓊脂液倒入小量筒中，量好14~15毫升，然後慢慢倒在玻板上，瓊脂向四周慢慢流淌正好充滿全板，澆板時動作太猛會使瓊脂溢出板外。但如動作太慢又會使瓊脂凝固而影響板的勻度。瓊脂板凝固後即可移入用數層濕紗布墊底的有蓋瓷盤中，置低溫處（如有冰箱則置冰箱中）保存備用。
3. 抗血清準備： 取抗CPV血清及抗DNV血清，標明血清效價及實用濃度置冰箱保存。
4. 樣品蠶準備： 根據調查目的選擇同批蠶中遲眠落小蠶或隨機抽樣蠶作檢查對象，前者可了解有無病毒病發生，後者可了解發病百分率，一般可於三齡開始檢查，樣品蠶需標明來源、品種及齡期。
具體操作
1. 樣品處理： 用鑷子將待檢蠶體皮撕開，取出中腸，並用彎頭鑷子將腸內容物輕輕擠出，腸壁置研缽中，如係三齡蠶可取3~5條蠶腸作一檢查區，四齡蠶可2~3條作一區，五齡蠶可1~2條作一區，單頭也可單獨檢查，先用研棒研磨使成勻漿，然後再加入腸容物5倍左右的碳酸鈉液研磨後靜置桌上。
2. 抗血清稀釋： 做雙向擴散時血清濃度要合適，太濃太淡都會使沉澱帶偏向一方而影響檢出，一般效價為1０24~2０48的抗CPV血清可用生理鹽水按1∶32~1∶64稀釋，效價為512的抗DNV血清用1∶16~1∶32的稀釋液。為提高檢出效果，每一樣品可用兩種血清濃度同時檢查。血清如已吸附在濾紙上，則根據吸附量先將濾紙用剪刀剪碎，按上述比例加生理鹽水浸泡3０分鍾後使用。
3. 瓊脂板打孔： 如待檢樣品少則可用組合式打孔，每組7孔，中央孔置抗血清，外周6孔置待檢樣品，每板可打4~5組孔，如樣品多則按排列式打孔，每三行為一組，每板三組可同時檢查42~48隻樣品。先在厚紙上按下圖模式畫好模板，打孔時將瓊脂板置模板上然後用打孔器按模板上小孔位置垂直按下，再將孔中瓊脂塊用扁針挑出或吸出，注意勿使孔口破裂或使瓊脂與玻板脫開。一般小孔直徑4毫米左右，抗原孔與抗體孔中心距離1０毫米左右。
4. 加樣： 用細滴管吸取待檢蠶中腸研磨上清液置周圍或上下行抗原孔中，如同時檢查CPV及DNV，則每一抗原（樣品）必須同時滴兩組或兩塊板的相應孔中，當滴完一個樣品時吸管需用清水衝洗數次然後再吸第二個樣品，抗血清用另一吸管滴加在中央孔或中間一行的血清孔中，加樣時盡可能使小孔充滿而又不溢出孔外，同時勿使產生氣泡，如有樣品或血清溢出孔外需用濾紙吸除。樣品加完後記錄好樣品編號及血清類別。