酶在基因工程操作中是不可缺少的工具，在基因工程中應用的酶統稱為工具酶（enzyme of tools）。例如，要取得所需要的目的基因DNA並與載體DNA連接在一起形成DNA重組體，首先要提供限製性內切酶和DNA連接酶。此外，還有其他工具酶，如T4多聚核苷酸激酶、堿性磷酸酯酶、核酸酶S1、反向轉錄酶和末端脫氧核苷酸轉移酶等。到目前為止，常用的工具酶已有3000多種。其中，根據1994年美國出版的《分子生物學百科全書》的統計數字，僅Ⅱ型核酸內切酶迄今就已從各種微生物中分離出2300種以上，可識別230種不同的DNA序列。
一、限製性內切酶
限製性內切酶（restriction endonuclease，RE）是一類專一性很強的核酸內切酶。它與一般的DNA水解酶不同之處在於它們對堿基作用的專一性及對磷酸二酯鍵的斷裂方式有所不同。這些酶在基因分離、DNA結構分析、載體的改造及體外重組中均起著重要作用。
（一）限製性內切酶種類
限製性內切酶有三種類型：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。Ⅰ型酶分子質量較大，在300ku左右，是一類複雜的多功能酶。作用時需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸等輔助因子。能切割未經修飾的DNA，但其切口識別序列特異性差。Ⅲ型酶屬雙功能酶，有兩種不同亞基，識別位點無規律，也需要較多的輔助因子參加。因此，Ⅰ型酶和Ⅲ型酶在基因工程中應用價值不大。
1970年，H.O.Smith、K.W.Wilcox和Kelly等人從流感嗜血杆菌Rd株中分離純化出第一個Ⅱ型酶，為基因工程的誕生奠定了基礎。後來陸續發現和提純了許多Ⅱ型酶。幾乎所有細菌的屬、種中皆發現至少有一種限製性內切酶。有的一個屬就有好幾種，同一品係的菌株中也常有識別不同序列的兩種酶。Ⅱ型酶分子質量較小（20～100ku），是一種簡單的單功能酶，作用時無需輔助因子或隻需Mg2+，能識別雙鏈DNA上特異的核苷酸序列，同時專一性強，而且其識別序列與切割序列相一致。這類酶特別適合於基因工程操作。
限製性核酸內切Ⅱ型酶中E.coRI應用最為廣泛，來源於E.coli變異株Ry13，分子質量58ku，由兩個相同亞基組成，已純化1500倍，能識別6個核苷酸序列。專一性很強，切割天然DNA可形成較大片段，並形成AATT黏性末端，可用於基因重組及DNA結構分析。
（二）限製性內切酶命名
1973年，H.O.Smith和Nathaus提出限製性內切酶的命名原則，是以宿主微生物屬名的頭一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（小寫）寫成斜體字的三個字母的縮寫。菌株名以非斜體符號加在這三個字母的後麵。若同一菌株中有幾種不同的限製性內切酶時，則以羅馬數字區分。例如，Hind Ⅲ表示從E.coli（流感嗜血杆菌）菌株d中分離出來的第3種限製性內切酶。又如，E.coRI表示從Escherichia coli（大腸埃希氏菌）菌株RY13中分離出的第1種限製性內切酶。
（三）限製性內切酶的作用機製和作用方式
脫氧核糖核酸是雙股鏈或單鏈以核苷酸為單位通過磷酸二酯鍵連接而成多聚核苷酸大分子物質。限製性內切酶的作用機製是以環狀和線形的雙鏈DNA為底物，在一定條件下，識別一定的核苷酸序列，在兩條鏈的特定的磷酸二酯鍵上催化切開，產生具有3′-OH基團和5′-p基團的片段所示。
其作用方式及識別位點有如下幾種：
1.識別不同的特異核苷酸序列
各種限製性內切酶對DNA識別序列的大小各有差異，有的識別6個核苷酸組成序列，有的識別5個或4個核苷酸序列，例如：