此後，作為全家族的希望（他哥哥已在戰場陣亡），肯尼迪開始步上政壇。29歲競選眾議員獲勝，到首都華盛頓上任，連任3屆（1947～1953年）。在國會裏，他對內重視社會救濟和平民福利，對外反對共產主義，支持冷戰，對杜魯門一度強壓蔣介石與中共聯合的政策表示不滿。1953年他進入參議院，正值麥卡錫反共運動盛行之時，大批聯邦公務人員以同情共產黨罪名遭清洗，肯尼迪對此並無異議，因為彼此家族關係友好。1956年寫成《勇敢者傳略》（又名《當仁不讓》，其中涉及他自己的脊背外科手術）一書出版，獲得普利策傳記文學獎，但也有人說此書係他人代筆。20世紀50年代後期任參議院外交委員會委員，力主擴大援助非洲和新獨立國家，政治觀點逐漸左移，在民主黨內聲望也逐步提高。1958年連任參議員。
1960年1月肯尼迪宣布競選總統，他與共和黨候選人尼克鬆的辯論（PK）是世界首次電視直播，表現出色，最後以微弱多數擊敗對手，成為美國曆史上最年輕的總統（43歲），也是唯一信奉天主教的總統。就職名言：“不要問你的國家能為你們做些什麼，而要問你們能為你的國家做些什麼。”他執政1037天，任職開始就遇到美國入侵古巴遭受慘敗的事件。1961年6月與蘇聯領導人赫魯曉夫在維也納會談，以強硬態度對待蘇聯要與東德單獨簽訂和約的威脅。1962年10月發現蘇聯在古巴設置導彈，他下令對古巴施行封鎖，迫使蘇聯撤出導彈裝置。10個月後，美、蘇、英禁止核試驗條約簽字。肯尼迪又組織拉美爭取進步同盟與和平隊。他提出大量削減所得稅的立法及擴大人權的立法，卻推遲到他死後才得以通過。他還改善城市住房條件、反對種族歧視、發展教育事業、保護天然資源、支持“阿波羅”登月太空計劃，卻大多受到國會阻撓。1963年11月在得克薩斯州達拉斯市為爭取連任做準備活動時遇刺身亡。
據稱肯尼迪整個家族有遺傳病史。肯尼迪一生都在與各種疾病做鬥爭，曾數次麵臨生命危險。在3歲生日的前3天，他患上惡性猩紅熱。1930年秋開始，他又患上一種無法確診的疾病，後定為愛迪生氏症（也叫腎上腺性青銅色皮膚病）。這種疾病使他內分泌發生紊亂，免疫力降低。此外拜二戰所賜，他還有慢性背部疾病。由於擔心自己健康問題影響到政治前途，一直以來他都在嚴格保密著醫療史，甚至這種隱瞞在他遇刺之後還在繼續。他一直以類固醇類藥物來抵製愛迪生氏症帶來的身體虛弱的影響，並依賴大量鎮靜劑（據說他還曾吸毒）、止痛藥、睪丸素、抗生素和安眠藥等來對付其他並發症。但另一方麵，他的健康問題一直是公眾和媒體關注的話題之一。
肯尼迪妻子傑奎琳，他們1953年結婚，有1個兒子和1個女兒，兒子小約翰·肯尼迪1960年出生，1999年因飛機失事遇難（最近有人披露，他曾與已故英國王妃戴安娜有關係——詳見本書《戴安娜》一文）。傑奎琳後嫁給希臘船王奧納西斯，而他曾經還是她妹妹的情人。肯尼迪生命中的重要人物還有弟弟羅伯特，曾任司法部長，據稱與嫂子傑奎琳有染（此外，肯尼迪最小的弟弟泰德也曾多年暗戀嫂子）；而好萊塢明星夢露是他們兄弟倆的情婦。
“風流總統”肯尼迪的女人當然不止她們二位。他曾與烏發碧眼、風綽豔麗的美女米蒂絲·凱貝爾有過2年曖昧關係。白宮裏也有他多名情人，包括某隱名女見習醫師，她大概就是肯總統的“萊溫斯基”了。肯尼迪在就職期間有過成串緋聞，不過他在世時公眾並不清楚他的這些風流韻事。
肯尼迪遇刺之謎
肯尼迪2
1963年11月22日，在副總統約翰遜陪同下，肯尼迪攜夫人傑奎琳來到達拉斯市為下一年總統選舉做準備，乘車遊街拜會市民。12時30分，當車隊徐徐拐入榆樹街時，突然聽到“砰！砰！”兩聲天籟般的槍響，隨後又是數聲，與前兩聲夾雜在一起，隻見敞蓬轎車上的肯尼迪先用手護住頸部，接著前額也被埋伏的槍手擊中，這是致命一擊。他的身體隨之猛地向後倒去，倒在傑奎琳膝上。她很驚慌地抱住他，全身沾滿鮮血。隨後總統被緊急送往帕克蘭醫院，13時院方宣布搶救無效死亡。
數小時後（一說是48小時內），重要嫌疑犯李·哈維·奧斯瓦爾德被警方抓獲，初步認定他即為刺客；但可疑的是，警方並沒對他提起訴訟，也未對他進行認真審訊。且此人僅2天後亦在眾目睽睽之下被槍殺，使案情趨於複雜化。
此案被稱為“人類20世紀最大醜聞和秘密”。美國公眾有點不敢接受這個殘酷的現實，他們迫切想知道究竟是誰刺殺了他們心目中年輕有為的總統。約翰遜宣誓接任後，下令組成以最高法院院長沃倫為首的調查組。1年後調查組提交報告認為，整個事件全是奧斯瓦爾德一人作案。此案於是被束之高閣。按照美國當局說法，《沃倫報告》將會保密至公元2047年，即要待所有當事人都過世後才公開。
美國民眾普遍表示不相信此結論。許多人認為，奧斯瓦爾德的被抓和被殺隻不過是官方一個掩人耳目的騙局而已。但由於當時一些目擊證人都先後神秘死去，而其內幕便成了人們心中永遠的謎。
肯尼迪與美國曆史上另一位遇刺的總統林肯有很多巧合：遇刺時間剛好相隔100年（1863、1963年），刺客年齡也剛好相隔100年（1839、1939年），兩人繼任者年齡也剛好相隔100年（1808、1908年）並都叫約翰遜，肯尼迪秘書姓林肯而林肯秘書姓肯尼迪。不過打死林肯的是左輪手槍，打死肯尼迪的是自動步槍，且刺客出現的位置也有很大區別。
肯尼迪的遇刺被視為對美國曆史發展產生重大決定性影響的事件之一，因為該事件在其後數十年中一直影響著美國政治的發展方向。
此後數年，民間有很多人士嚐試調查此案，並出版了相當數量的暢銷書和影視作品。1991年12月，美國、法國合作拍攝影片《刺殺肯尼迪》，由奧利弗·斯通導演兼編劇，凱文·科斯特納主演。
在過去40餘年裏，關於肯尼迪遇刺的內幕至少有36種不同版本。在層出不窮的結論中，古巴卡斯特羅政府、前蘇聯克格勃、美國中情局甚至副總統約翰遜都曾被列為懷疑對象（所謂政治陰謀論）。也有人認為凶手純粹是為出名，或是保鏢走火誤傷。還有一說肯尼迪隻是替死鬼，凶手真正瞄準的目標是德州州長約翰·康納利。曾參與搶救工作的外科大夫查爾斯·克倫肖則毫不動搖地相信：“總統是被迎麵射來的槍彈擊中，並非奧斯瓦爾德在樓房頂上居高射中，凶手是另外一個人。”
2003年美國著名作家布拉德·奧利裏和西摩在參考大量文件、資料、證據並采訪許多知情人以後，撰寫了《死亡的三角地帶》一書。該書指出，肯尼迪曾下令美國中情局“解決”了過於囂張殘忍的“越南共和國”（即南越，其實是個反共組織）總統吳庭豔，而吳餘黨進行報複。且有著美國黑社會“教父”之稱的博納諾斯也參與其中，奧斯瓦爾德隻是他們的替罪羊。