二、脫鈣法及脫鈣液配製
脫鈣液均為酸性劑，有用有機酸，有用無機酸，而用於配製脫鈣液的藥品中以硝酸為最佳，因硝酸脫鈣迅速，無膨脹組織和妨礙染色之弊。下麵是幾種常用的脫鈣液及脫鈣法。
（一）5％硝酸脫鈣法
（1）骨組織（2～5mm厚）浸入5％硝酸水溶液2～7天，每天換新液一次。
（2）流水衝洗12～24小時。
（3）80％乙醇硬化12～24小時。
（4）脫水，包埋。
（二）Schridde液脫鈣法
在此溶液中硝酸比例較大，故其脫鈣能力比較強。
（1）骨組織在Schridde液中37℃浸透2～3小時。但長達12～24小時組織亦無多大妨礙。
Schridde液的配製方法：40%甲醛10ml，蒸餾水90ml，硝酸20ml。
（2）流水衝洗24小時。
（3）在80％乙醇中硬化12小時左右。
（4）脫水，包埋。
（三）Von Ebner液脫鈣法
（1）將骨組織浸入Von Ebner液中，每天加1～2ml鹽酸，到骨組織軟化為止。
Von Ebner液的配製方法：氯化鈉飽和水溶液100ml，4％鹽酸100ml。
（2）80％乙醇硬化。
（3）透蠟、包埋。
（四）Bayley液脫鈣法
（1）骨組織浸入Bayley液3～7天。
Bayley液的配製方法：冰醋酸2份，10％甲醛10份。
（2）置於10％硝酸水溶液中1～2天，直至軟化為止。
（3）取出後於無水乙醇中脫水。
（4）氯仿處理12小時。
（5）透蠟、包埋。
（五）Morse液脫鈣法
（1）骨組織浸入大量Morse混合液中，每天更換新液一次。
Morse液的配製方法：A液：90％甲酸1份，蒸餾水1份。B液：枸櫞酸鈉20g，蒸餾水100ml。A液和B液於使用前現配，等量混合作用。
（2）流水衝洗4～8小時。
（3）組織軟化後用正丁醇脫水。
（4）包埋切片。
（六）Plank和Rycho法
此法對組織染色很少有不良影響，其脫鈣時間較快。頭顱骨1cm×1cm×0.5cm需要24小時，大腿骨7小時，其速度較用三氯醋酸或硝酸等可快數倍。
配製方法：氯化鋁（結晶）7g，鹽酸（37％）8.5ml，甲酸（95％）5ml，蒸餾水100ml。
三、脫鈣兼固定方法
（一）McNamaraz液脫鈣法
骨組織浸入大量McNamaraz混合液中，每天更換新液一次，直至骨軟化為止。如果超過7天，核染色會破壞，脫鈣後流水洗24小時。脫水，包埋。
配製方法：A液：氯化汞10g，蒸餾水300ml，加熱溶解後加三氯醋酸30g，蒸餾水5ml。B液：濃硝酸5ml，95%乙醇50ml，甲醛40ml。將A液和B液混合。
（二）Schmidt脫鈣法
骨組織浸入Schmidt液24~48小時，pH7~9，處理後將組織直接放到70%的乙醇中，如常法脫水和包埋。
Schmidt液的配製方法：4%甲醛加1g，醋酸鈉100ml，二乙胺四醋酸鈉10g。
（三）Lillie脫鈣法
Lillie液配製方法：1~2%苦味酸85ml，甲醛10ml，90%~95%甲酸5ml。
（四）入Lillie改良液
Lillie改良液的配製：加5%的90%甲酸至Zenker固定液中。
四、脫鈣兼脫水方法
使用大量Jenkin液，40~50倍於組織的大小，處理後放到無水乙醇中數次，然後透明、包埋。
Jenkin液（Culling改良）的配製方法：無水乙醇73ml，蒸餾水10ml，氯仿10ml，醋酸3ml，濃鹽酸4ml。
五、電解脫鈣法
此法對組織脫鈣迅速，好用。如條件許可，有此設備，尤為方便。此法用電解液通過6V直流電，進行電離脫鈣。
組織脫鈣時，用8％硝酸和10％甲酸混合置於蓋有標本的方形玻璃瓶內。瓶蓋上兩端各開一小孔，將兩根白金線各穿過一小孔。一根為陽極，其一端係上白金線小籠，內置骨塊。另一根為陰極，兩極相距之間，懸一密孔塑膠筒。脫鈣數十分鍾至3小時，一般硬骨塊便可完全脫鈣。製成切片，染色效果良好。
六、骨組織化學常用的脫鈣法
（一）EDTA脫鈣
廣泛用作脫鈣的螯合劑是乙二胺四乙酸（EDTA），實係其二鈉鹽，它與骨的作用是僅與鈣離子結合，且隻作用於磷灰石表層，形成可溶性的非離子性化合物，待表層缺失，遂由內部的離子再予形成。故在脫鈣過程中，該晶體逐漸減少，直至“脫鈣”作用完成。這一過程作用較緩慢，組織塊必須很小，至少有一側厚度要在1~2mm以內，在7天內完成。期間要不斷攪動，脫鈣劑要每日更新。為保持酶活性，溫度宜保持在4℃下進行。切片脫鈣24~36小時即可，其間更新脫鈣劑數次。EDTA的脫鈣對組織成分及染色影響很小或無，並可用以顯示堿性磷酸酶。通常用EDTA二鈉鹽的5％或10％溶液脫鈣。
（1）5％EDTA二鈉鹽，溶於蒸餾水，用0.1N氫氧化鈉調至pH7.0左右。pH5.8～6.8利於保存切片內堿性磷酸酶的活性。
（2）10％EDTA二鈉鹽，溶於0.1mol/L磷酸緩衝液，以氫氧化鈉調至pH7.0。
（3）10％EDTA二鈉鹽，溶於0.1mol/L Tris緩衝液，pH7.0～7.4。該液脫鈣速度快於上液。
組織塊和切片脫鈣後，要用冷蒸餾水或冷緩衝液充分浸洗，除盡EDTA，以消除它對組化反應的不良影響。
（二）甲酸-枸櫞酸鈉液脫鈣
顯示酸性磷酸酶以此液脫鈣的效果較好。脫鈣法有：
（1）小塊骨於脫鈣液內在4℃脫鈣數日。隔日換新液。
脫鈣液的配製方法：甲液：88％甲酸24ml，溶於蒸餾水1032ml；乙液：枸櫞酸鈉200g，溶於蒸餾水1000ml。使用前，取等量甲液和乙液，混合後，用88％甲酸調至pH5.0，即可使用。
（2）未脫鈣骨切片於脫鈣液內在4℃脫鈣24小時。其間換新液數次。標本脫鈣後，用冷蒸餾水充分洗，以除去脫鈣劑。
脫鈣液的配製方法：88％甲酸25ml，20％枸櫞酸鈉水溶液50ml，蒸餾水47.5ml。pH應為4.2。若低至pH3.8，酶活性被破壞。
第四節 脫鈣骨切片常用的染色法
一、鈣質染色法-Kossa法
病理組織所見的鈣鹽沉著有呈顆粒狀的，也有呈塊狀的，多屬碳酸鈣或磷酸鈣兩種。在常規組織染色中用Von Kossa銀以顯示鈣沉積，這是因為組織中磷酸鹽及碳酸鹽的存在，而不是因為鈣的存在。在動物組織內不溶性磷酸鹽及碳酸鹽通常是鈣鹽，因此這種試驗常作為對鈣的反應試驗。這種方法的原理是將上述兩種鹽變為相當的銀鹽，然後再用日光、紫外線或是強還原劑使其還原為黑色金屬銀。
染色步驟：
（1）用酒精或10％甲醛溶液固定的切片或冷凍石蠟均可，此法用於缺鈣或不完全脫鈣的骨組織。
（2）切片脫蠟至蒸餾水。
（3）入5%硝酸銀水溶液10~60分鍾。
（4）蒸餾水洗，入1%焦性沒食子酸還原數分鍾。
（5）硫代硫酸鈉固定3~5分鍾。
（6）徹底水洗，經酒精、二甲苯，封固。
結果：含鈣部分呈黑色。