五、原位雜交
（一）原理
核酸保持在細胞或組織切片中，經適當的方法處理細胞或組織後，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交（in situ hybridization）。RNA－DNA原位雜交的原理和分子雜交其他方法的原理是一樣的。不同之處在於其他方法都是將RNA提取出來後進行分子雜交，而原位雜交則是將mRNA保持在細胞內原有的位置，細胞或組織則盡可能保持原有形態。將細胞或組織以適當方法固定之後，除去脂類並適當消化細胞內的蛋白質，增大細胞對大分子物質的通透性，使DNA探針便於出入細胞。與免疫組化相結合，原位雜交可以將顯微鏡下的組織形態學資料與DNA、mRNA、蛋白質水平的基因活動聯係起來。進行分子雜交之後，將細胞或組織切片置於顯微鏡下觀察，可確定不同細胞內的基因表達情況。原位雜交對組織中含量極低的靶序列有很高的靈敏度，並可完整的保持組織與細胞的形態，更能準確的反映組織細胞的相互關係及功能狀態。
（二）主要儀器、材料和試劑
1.主要儀器和材料烤箱、CO2培養箱、顯微鏡、玻璃載玻片、蓋玻片。
2.試劑DNA探針、地高辛標記試劑盒、去離子甲酰胺、檸檬酸鈉、葡聚糖硫酸酯、鮭精DNA、封閉液（用於細胞原位雜交）：100mmol／L Tris-HCl（pH7.5），150mmol／NaCl、不含酚紅的DMEM培養液、多聚賴氨酸、PBS、細胞固定液：4％（W／V）甲醛，5％（W／V）醋酸，0.9％（W／V）NaCl、乙醇（70％，90％，100％）、二甲苯、胃蛋白酶、0.5％封閉試劑（封閉試劑—般為匆5粉或正常羊血清）、抗DIG-熒光素抗體、Tween 20、明膠、硫酸鉻鉀多聚甲醛、矽氫化物、丙酮、組織固定液、含4％多聚甲醛的PBS（pH7.5）、蔗糖、蛋白酶K、封閉液（用於組織切片原位雜交）：100mmol／L Tris-HCl（pH7.5），150mmol/L NaCl，0.1％Triton X-100，2％正常羊血清、堿性磷酸酶標記的抗DIG抗體（抗DIG-AP）、NBT溶液：溶於70％二甲基甲酰胺，75mg／ml、BCIP溶液：溶於100％二甲基甲酰胺，50mg／ml、levamisole（Sigma）溶液：配成1mmol／L，0.24g／ml。
（三）操作步驟
體外培養細胞中進行的原位雜交
1.細胞的固定
（1）在37℃，5％CO2條件下將細胞在多聚賴氨酸包被的顯微鏡載玻片上培養，用不含酚紅的DMEM培養液培養細胞。培養時間通過預實驗確定。
（2）用37℃的PBS洗細胞後，室溫下將其在細胞固定液（4％甲醛，5％醋酸，0.9％NaCl溶液）中固定30分鍾。
（3）室溫下，用PBS洗滌固定的細胞，將其置於70％酒精中，貯存於4℃。
2.細胞雜交前的預處理
進行原位雜交之前，將固定的細胞進行如下處理：依次在70％、90％、100％乙醇中浸泡，脫水。用二甲苯洗滌，除去殘留的脂質。依次在100％、90％、70％乙醇中浸泡，進行再水化。然後浸泡於PBS中。在37℃用溶於0.1N HCl的胃蛋白酶處理固定的細胞，以增加細胞對大分子試劑的通透性。最後，按如下步驟處理固定的細胞：用PBS洗5分鍾，再用1％甲醛固定10分鍾，用PBS洗淨。
3.原位雜交
（1）用地高辛標記DNA探針。
（2）準備雜交液：60％去離子甲酰胺，300mmol／LNaCl，30mmol／L檸檬酸鈉，10mmol／L EDTA，25mmol／L NaH2PO4（pH7.4），5％葡聚糖硫酸酯，250ng／μl變性的鮭精DNA。
（3）臨用前，將DIG標記的DNA探針在80℃加熱變性，將其加入雜交液中，至終濃度5ng／μl。
（4）將10μl雜交混合液（雜交液加變性的探針）加入到固定並增加了通透性的細胞上，蓋上一塊18mm×18mm的蓋玻片。
（5）於37℃雜交16小時。
4.雜交後的洗滌
（1）雜交後，將載玻片在60％甲酰胺、300mmol/L NaCl、30mmol／L檸檬酸鈉溶液中於室溫下振蕩，去掉蓋玻片。
（2）用上述溶液洗載玻片：室溫洗滌，3×5分鍾；37℃洗滌，1×5分鍾。
（3）最後將載玻片在PBS中浸泡5分鍾。
5.雜交結果的檢測
（1）每塊載玻片上加100μl封閉液［100 mmol／L Tris-HCl（pH7.5），150mmol／L NaCl，0.5％封閉試劑］，封閉非特異性結合位點。
（2）以同樣的封閉液將抗DIG-熒光素抗體按1：500稀釋，加在載玻片上，置濕盒內溫育45分鍾。
（3）用100mmol／L Tris-HCl（pH7.5），150mmol／L NaCl，0.05％Tween 20洗載玻片。將細胞樣品依次在70％、90％、100％乙醇浸泡5分鍾，脫水。再將載玻片在空氣中幹燥。
（4）將細胞樣品包埋在防褪色溶液中。該溶液是以九份甘油與一份染液｛1mmol／L Tris- HCl（pH7.5），2％ 1，4-diaza-bicyclo［2，2，2］-octane，500ng／ml propidiumiodide｝配製而成。
組織切片中進行的原位雜交
1.準備載玻片明膠包被載玻片：適合於從冰凍或石蠟包埋標本製備較大的組織切片。
（1）將載玻片在清潔液中浸泡10分鍾，用自來水衝洗，最後用蒸餾水漂洗。
（2）製備明膠溶液：將10g明膠溶於1000ml已加熱到40～50℃的蒸餾水中。加入4ml 25％硫酸鉻鉀溶液，硫酸鉻鉀溶液的終濃度為0.1％。
（3）將載玻片在明膠溶液中浸泡10分鍾。
（4）將載玻片置空氣中幹燥。然後在含有1％多聚甲醛的PBS（pH7.4）溶液中浸泡10分鍾。
（5）將載玻片置空氣中幹燥。然後置60℃烘烤過夜。
矽氫化物包被載玻片：適用於較小的組織切片或細胞樣品。
（1）將潔淨的玻璃載玻片在矽氫化物溶液（5ml 3-aminopropyltriethoxysilane稀釋於250ml丙酮）中浸泡60分鍾。
（2）在蒸餾水中洗滌載玻片，2×10分鍾。
（3）將載玻片置60℃幹燥過夜。
2.組織製備
冷凍切片
（1）將組織切成2mm厚的切片。
（2）新鮮配製並過濾固定液（DEPC處理的PBS，含4％多聚甲醛，pH7.5），將切下的組織置固定液中，於4℃浸泡2～4小時。