（三）未標記抗體法
由於抗體和酶或熒光素以化學方式結合後，或多或少地降低了抗體和抗原結合的能力，並且對標記物的活性也有影響，所以不用化學方法使抗體和標記物結合的方法得到發展。Mason等1969年報告了酶橋法，Sternberger等1974年報告了PAP法。
1.酶橋法（enzyme bridge technique）
使用的三種抗體中的第一、三兩種為同種動物所產生。如第一抗體為兔抗人Ig，第二抗體為羊抗兔Ig，第三抗體為兔抗過氧化酶。在染色中的關鍵是第二抗體（橋抗體）必須以較高的濃度過量使用，以確保雙價的橋抗體的一價與一抗結合，而另一價與三抗結合。最後以遊離的過氧化酶加入，洗去未結合的酶後顯色。
酶橋法大大地提高了反應的敏感性，其缺點是遊離的酶難以精確地稀釋到所需要的濃度，以達到和三抗的抗酶部位全部結合；與組織中其他成分非特異結合的酶也難以全部洗去，因此背景染色較重。此法未得到廣泛地使用。
2.PAP法
PAP為peroxidase antiperoxidase的縮寫。此法是在酶橋法的基礎上改進而成的。將遊離酶和抗酶抗體在使用前先製成穩定的酶-抗酶抗體複合物（PAP複合物），再稀釋後使用，解決了酶與抗酶抗體的比例難以確定的問題。經測定PAP複合物由兩分子抗酶抗體和三分子酶組成，為直徑20.5nm的環形分子，分子量為432kD。小而穩定的PAP複合物的穿透性較好，容易達到抗原部位。此法較間接熒光法敏感約20倍，較間接酶標法敏感約100倍，而且非特異染色極輕微。故得到了廣泛地使用，成為多克隆抗體時代石蠟包埋組織免疫組織化學的標準方法之一。
PAP法的關鍵在於：①PAP複合物中的抗酶抗體必須與第一抗體為同種動物所產生；②第二抗體（橋抗體）必須過量，以保證第二抗體分子的兩個結合部位分別與一抗和抗酶抗體結合。
3.APAAP法
APAAP是堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）－抗堿性磷酸酶抗體（anti-AP）複合物的簡稱。此法由Mason等1983年首次報告。用AP取代PAP法的過氧化物酶（P），原理與PAP法相似。APAAP法由於避免了使用有致癌嫌疑的DAB，顯色對比好，在國外得到廣泛地使用。
（四）親和素－生物素方法
親和素－生物素標記係統用於免疫組織化學染色的方法主要有三類。
1.親和素－生物素－過氧化物酶複合物技術（avidin biotin peroxidase complex technique，簡稱ABC）通過ABC複合物中親和素的橋梁作用，將ABC複合物與生物素化的抗體結合在一起，達到檢測抗原的目的。ABC的配製是將親和素與酶標生物素按一定比例結合而成。
2.酶標親和素－生物素技術（labeled avidin biotin technique，BA或LAB技術）製備生物素化抗體和酶標親和素，利用生物素-親和素的親和作用，將酶標親和素連接到抗原抗體複合物上，以顯示被檢測的抗原。
3.橋聯親和素-生物素技術（bridged avidin biotin technique，BAB或BRAB技術）是用生物素分別標記抗體和酶，然後以親和素為橋，將兩者連接在一起；根據染色過程中是否使用第二抗體，上述三類技術均有直接法和間接法之分。
ABC法在上個世紀80年代由許世明博士推出後，成為應用最為廣泛的免疫組織化學方法。ABC法的關鍵是ABC複合物的配製。在商品化試劑盒中，ABC複合物在使用前半小時由等體積的A液和B液稀釋而成。A液為親和素液，B液為生物素結合的過氧化物酶液。配製成的ABC複合物中的一個親和素分子隻結合三個與酶交聯的生物素分子，而留下一個結合位置給二抗上的生物素。與PAP法相比較，ABC法的最大優點是敏感性高，是PAP法的20～40倍。其次是背景清晰，尤其適用於單克隆抗體。
ABC法在使用中產生變型，如LAB法、LsAB法、ABPAP法。ABC複合物是以一個親和素分子結合三個酶聯生物素分子組成的。而LAB法則用親和素分子直接與酶分子結合，形成酶-親和素複合物，再與生物素標記的二抗結合，故名LAB法（1abelled avidin biotin.LsAB法則以鏈親和素（streptavidin，SA）代替親和素（又稱S-P法）。據報告，LAB法較ABC法敏感4～8倍，而LsAB法采用的鏈親和素由於避免了與切片中的內源性生物素結合的可能，其特異性更高。現在以LsAB試劑替代ABC試劑已得到廣泛地使用。
A.Envision法；B.CSA法
（六）雙重和多重免疫組化染色
為了在同一張組織切片或細胞學塗片上同時或先後顯示兩種或兩種以上的抗原，發展了雙重和多重免疫組化技術。這對於在原位了解不同抗原的關係，將形態與功能相結合極為有用。近年來，雙重標記技術結合了免疫組化和核酸分子雜交技術，已跨越蛋白質水平，進入DNA、RNA水平，可在同一細胞內顯示兩種不同的DNA或mRNA，或者顯示DNA和蛋白質。也有人以放射性核素標記和酶組織化學結合來顯示靶DNA和抗原。
雙重染色的基本方法有雙重熒光和雙重酶標記法。雙重熒光標記最常用的是FITC和TMRITC或RB200。雙重酶標記常用的是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。染色方法主要有以下兩種。
1.阻斷法
即是在第一種抗原染色完成後，以酸性溶液洗脫第一重標記的Ag-Ab複合物，以防止第二重染色時的交叉反應。然後進行第二重染色。例如我們曾用過氧化物酶標記的親和素-生物素係統顯示細胞增殖核抗原（PCNA），顯色後酸洗；再用堿性磷酸酶標記的親和素，生物素係統顯示T細胞標記UCHL l或B細胞標記L 26，這樣可以確定增殖細胞的性質。
2.非阻斷法
用不同的標記物和不同種族的抗體來避免交叉反應。例如在流式細胞術中，用FITC標記的鼠抗人κ和RB200標記的鼠抗人λ來同時顯示B細胞的輕鏈限製性。
雙重標記法的操作複雜，花費時間及試劑多，影響結果的因素多，隻宜在科研中應用。
（七）免疫組化染色方法選擇的原則
要根據需要證明的抗原的種類、標本中的抗原保存情況、實驗的精度要求和實驗室的條件來選擇最佳的方法。簡單來說，就是五個“S”。
1.“specificity”，即特異性例如，要證明組織中的細胞角蛋白以區分來源於上皮的癌和來源於間葉組織的肉瘤，可選用多克隆的抗角蛋白抗體，其特異性較廣；而要區分來源於鱗狀上皮的鱗癌和來源於腺上皮的腺癌，則應選用特異性更高的抗角蛋白不同家族成分的單克隆抗體。特異性的計算方法為：