船長和薇奧拉來到由奧西諾公爵統治的伊裏利亞城。伊裏利亞城裏有位年輕美貌而又富有的伯爵小姐奧麗維婭。她心地善良，父親去世後她與哥哥相依為命。不久，哥哥也去世了。
為了表示對哥哥的哀悼，奧麗維婭發誓不再與任何男人來往。
因此，她拒絕了奧西諾公爵的求婚。薇奧拉聽了船長的介紹，對奧麗維婭產生了好感，尤其讚賞奧麗維婭對哥哥的深情，因為她自己也沉浸在失去哥哥的悲傷之中。她起先打算給奧麗維婭當侍女，無奈奧麗維婭不見任何外人。於是，她就在船長的幫助下，女扮男裝，改名為西薩裏奧當上了奧西諾公爵的侍童。
薇奧拉自小受過良好的教育，舉止文雅，談吐不凡，再加上相貌英俊，有一副美妙的歌喉，很快就獲得了公爵的寵愛，把她當成自己的知心人。奧西諾向她傾訴了自己對奧麗維婭的愛情，並請求她替自己向奧麗維婭求婚。薇奧拉十分不情願地答應了他的要求，因為她自己已不知不覺地愛上了公爵。她曾給奧西諾一些暗示，但他沒有能理解，薇奧拉隻好等待時機。
薇奧拉來到奧麗維婭的門前要求見她，但遭到了拒絕。薇奧拉表示“要像州官衙門前豎著的旗杆那樣”，像“凳子腳一樣直挺挺地站著”，並一直站下去直到奧麗維婭和她見麵說話為止。她的話激起了奧麗維婭的好奇心，就答應見一見薇奧拉。風度翩翩的薇奧拉以一番漂亮的言詞打動了奧麗維婭的心，她情不自禁地愛上了這個氣度不凡的“美少年”。薇奧拉離開之後，她又派人追上去送了一枚戒指給她，以表達自己的愛慕之心。此後，薇奧拉便可以自由地出入於奧麗維婭的家中。當她向薇奧拉求愛時，薇奧拉堅決地拒絕了，並說：“我永遠不會愛任何一個女人。”
一直想追求奧麗維婭的安德魯爵士聽說她已經愛上了公爵的侍童薇奧拉時，不禁妒火中燒，向薇奧拉提出決鬥。薇奧拉麵對這個氣勢洶洶的挑戰者，束手無策，驚慌不已。就在這關鍵時候，一個過路人拔劍相助，救了薇奧拉。這個過路人名叫安東尼奧，就是他在海上救了薇奧拉的哥哥西巴斯辛，當他了解了西巴斯辛的身世後，自願做西巴斯辛的隨從。他這次和西巴斯辛來到伊裏利亞城，西巴斯辛帶著錢袋去買東西，安東尼奧到處逛逛，就碰見了受到安德魯挑戰的薇奧拉。因為薇奧拉和西巴斯辛長得一模一樣，他誤以為那是西巴斯辛，所以才拔劍相助。這時，兩個警吏過來，將安東尼奧逮捕，理由是他參與了鬥毆。臨走時，安東尼奧向薇奧拉要錢袋，薇奧拉莫名其妙，否認自己認識安東尼奧，更別說什麼錢袋了。但為了感謝他的幫助，她願意將她隨身攜帶的錢分一半給他。安東尼奧對她的態度十分惱火，大罵她忘恩負義，並稱她為“西巴斯辛”。
薇奧拉剛想問清原由，警吏就匆匆把他押走了。薇奧拉心中閃過一個念頭，可能是他把她錯認為自己的哥哥西巴斯辛了，她十分高興，帶著與哥哥重逢的希望，回到奧西諾公爵府中。
薇奧拉走後，西巴斯辛來找安東尼奧。怒氣未消的安德魯錯把他當成了薇奧拉。於是，兩人打了起來。這時，奧麗維婭聞訊從家中趕來勸解，她也把西巴斯辛當成薇奧拉了。她把西巴斯辛邀請到家中，熱情款待，弄得西巴斯辛不知所措，如墮霧中。在花園裏，奧麗維婭拿出一顆珍珠向他表示愛意。他心裏想這位小姐也許是有點神經錯亂。但他又看到她華麗的住宅，一切事務都管理得井井有條。除了她突然愛上他這一點以外，其他的方麵看起來都很正常。於是，他高興地接受了她的求愛。奧麗維婭看到薇奧拉的態度發生了很大的變化，心中十分高興。但她又怕他再變卦，就說她家裏有位神父，提議兩個人馬上舉行婚禮。西巴斯辛同意了這個提議。婚禮結束之後，他對奧麗維婭說他要出去一下，因為他急於要去對安東尼奧講述他的奇遇。
這時，奧西諾公爵帶著侍童薇奧拉再次登門向奧麗維婭求婚。在奧麗維婭家門口，遇到警吏押著安東尼奧走過來。安東尼奧仍把薇奧拉當作西巴斯辛，一見他，就大罵他忘恩負義。
安東尼奧向公爵講述了自己是如何冒著生命危險將他從海中救起，又是如何對他付出了真摯的友誼，以及他又是怎樣翻臉不認人的。奧麗維婭聞聲走出來，一見薇奧拉就親熱地稱之為“我的丈夫”。奧西諾公爵一聽，立刻指責薇奧拉奪走了自己的意中人。這時，薇奧拉就是渾身是嘴也辯解不清了。公爵堅信她做了對不起自己的事，宣布與她永遠分手。就在這時，西巴斯辛出現在眾人麵前，並稱奧麗維婭為妻子。薇奧拉一眼認出了自己的哥哥，隨後也公開了自己的身份。由於這一對孿生兄妹長得一模一樣而造成的種種誤會終於弄清楚了，大家都笑奧麗維婭居然陰差陽錯地愛上了一個女人。可是，奧麗維婭並沒有什麼不高興，因為最終她嫁了一個和薇奧拉長得一模一樣的丈夫。
奧麗維婭已經結婚，這使公爵的希望永遠破滅了。但他的心弦又被美麗的薇奧拉撥動了。回憶起以前薇奧拉對他所說的話，他這時才體會到其中的濃情蜜意。奧西諾公爵認定他的妻子應該是薇奧拉。
在奧麗維婭的提議下，奧西諾和薇奧拉，奧麗維婭和西巴斯辛在同一天、由同一位神父主持舉行了婚禮。
薇奧拉是這部戲劇中最富光彩的形象，她聰明過人又生性溫柔，是個對愛情執著追求而又極富犧牲精神的女性。
在遇難之後，她女扮男裝充當奧西諾公爵的侍童。憑著她的善解人意和動人的聲音，很快贏得了公爵的信任，而她自己也不由自主地墜入了情網。但現實不允許她向公爵表白。她不僅不能得到公爵的愛，而且還要替他向奧麗維婭求愛，這是怎樣的一種痛苦呀！但她堅強地去麵對這一切，在執行使命的過程中，她竭盡全力，表達了公爵對奧麗維婭的愛。她越是忠實地完成她的使命，越顯示了她高尚的自我犧牲精神。
與此同時，她又從不曾放棄過追求自己愛情幸福的權利。
在經過多番努力仍不能使公爵得到奧麗維婭的愛的情況下，她用各種巧妙的方式，含蓄地向公爵表達自己熾熱的愛情。她常常在公爵麵前以女人自喻，說自己若是個女的，就會愛上公爵這樣的人，但決不會像愛公爵一樣去愛一個女人。這些深情、機智的話語，既顯示了她的智慧，又表達了她對公爵不渝的愛情。最後她終於獲得了自己的幸福，這也是一切善良的人所希望的結局。薇奧拉是莎士比亞筆下“最可愛的”女性形象之一。
劇中除了表現幸福的愛情生活之外，莎士比亞還順便諷刺了清教徒的禁欲主義生活態度。這體現在奧麗維婭的管家馬伏裏奧身上。
在劇中，他是個惹人討厭的角色。通過奧麗維婭的女仆瑪利婭的話，莎士比亞三言兩語勾勒出了這個人物的形象：
他是個鬼清教徒，反複無常，逢迎取巧是他的本領；一頭裝腔作勢的驢子，背熟了幾句官話，便倒也似的倒了出來；自信非凡，以為自己真了不得，誰看見他都會愛他……為了讓他暴露出自己的真麵目，瑪麗婭偽造了一封奧麗維婭的情書丟在花園中。他撿到情書後，醜態畢露，以為小姐真的愛上了自己，幻想著馬上就要當上伯爵，就要發財了。結果卻出盡了洋相。他認為戀愛是獲得財富、地位、實現野心的一種手段。他的卑劣和男女主人公的崇高形成了鮮明的對比。
《第十二夜》的語言充滿抒情色彩，奧西諾的語言感傷憂鬱，奧麗維婭的語言則多愁善感，薇奧拉的語言又華麗動人。
同時，莎士比亞還在劇中穿插了大量的詩句，既表達了某種思想，又增加了全劇的音樂美和韻律美。例如：
給我引道到芬芳的花叢；相思在花蔭下格外情濃。
（一幕一場）
但無論如何我愛你太深；履險如夷我定要把你尋。
（二幕一場）
女人正像是嬌豔的薔薇，花開才不久便轉眼枯萎。
是啊，可歎她刹那的光榮，早枝頭零落留不住東風。
（二幕四場）
《第十二夜》是莎士比亞早期喜劇創作的終結。他以抒情的筆調，浪漫喜劇的形式，再次謳歌了人文主義對愛情和友誼的美好理想，表現了生活之美，愛情之美。幾百年之後，它的巨大藝術魅力依然不減，讀起來令人心曠神怡，精神愉悅。